Tirando nanotubi di membrana da vescicole unilamellari gigante

Summary

Molte proteine nella cellula senso e inducono la curvatura della membrana. Descriviamo un metodo per tirare nanotubi di membrana da vescicole lipidiche per studiare l’interazione delle proteine o qualsiasi molecola di curvatura-attivo con membrane curvo in vitro.

Abstract

Il rimodellamento della membrana cellulare è parte integrante di molti fenomeni cellulari, come ad esempio endocitosi, traffici illeciti, la formazione di filopodi, ecc. Molte proteine diverse associano con membrane curve a causa della loro capacità di percepire o indurre la curvatura della membrana. In genere, questi processi comportano una moltitudine di proteine che li rende troppo complessa per studiare quantitativamente nella cella. Descriviamo un protocollo per ricostituire una membrana curvilinea in vitro, che imita una struttura cellulare curva, come il collo di endocitosi. Delle vescicole unilamellari gigante (GUV) viene utilizzata come modello di una membrana cellulare, in cui pressione interna e la tensione superficiale sono controllato con l’aspirazione di una micropipetta. L’applicazione di una forza di trazione di punto su GUV utilizzando pinzette ottiche crea un nanotubo ad alta curvatura collegato ad una membrana piatta. Questo metodo è stato utilizzato tradizionalmente per misurare le proprietà meccaniche fondamentali delle membrane lipidiche, quali rigidità di piegamento. Negli ultimi anni, esso è stato ampliato per studiare come le proteine interagiscono con curvatura della membrana e il modo che interessano la forma e la meccanica delle membrane. Un sistema che unisce la micromanipolazione, microiniezione, Pinzetta ottica e microscopia confocale permette la misura della curvatura della membrana, tensione nelle membrane e la densità di superficie delle proteine, contemporaneamente. Da queste misurazioni, si può dedurre molte importanti proprietà meccaniche e morfologiche del sistema proteina-membrana. Inoltre, abbiamo stendere un protocollo di creazione GUV in presenza di concentrazione salina fisiologica e un metodo per quantificare la densità superficiale delle proteine sulla membrana da intensità di fluorescenza di etichettato proteine e lipidi.

Introduction

Molti processi cellulari, come endocitosi, traffici illeciti, la formazione di filopodi, infezione, ecc., sono accompagnati da un drammatico cambiamento nella forma di membrane cellulari^1,2. Nella cella, un numero di proteine partecipa a questi processi legandosi alla membrana e alterare la loro forma. Gli esempi più notevoli sono membri della famiglia di proteine Bin/anfifisina/Rvs (BAR), contenente una caratteristica intrinsecamente curvata BAR dominio^3,4,5,6,7. In genere, essi interagiscono con la membrana aderendo il dominio di BAR alla superficie e, in molti casi, anche superficialmente inserimento eliche amphipathic in doppio strato. La forma, la dimensione e la carica del dominio BAR insieme al numero delle eliche amphipathic determina: (1) la direzione della curvatura della membrana (cioè, se inducono i invaginations o sporgenze) e (2) l’entità della membrana curvatura^5,8. Di nota, qui curvatura positiva è definito come il lato convesso della membrana curvilinea, vale a dire, il rigonfiamento verso la particella interagente e negativa altrimenti. Inoltre, gli studi quantitativi di BAR proteine ha rivelato che il loro effetto sulla membrana dipende un set di parametri fisici: densità di proteine, tensione nelle membrane e forma di membrana (piatto contro tubolare contro sferica di superficie forma)⁷. In base a questi parametri BAR proteine può: (1) fungono da sensori di curvatura della membrana, (2) piegare membrane o (3) indurre membrana scissione⁷.

Dovuto il numero di componenti coinvolti nella membrana rimodellamento nella cella, studiando gli aspetti quantitativi dei fenomeni, quali endocitosi, in vivo è estremamente impegnativo. In vitro la ricostituzione del numero minimo di componenti che imita curve membrane nella cella fornisce mezzi per acquisire una comprensione meccanicistica di proteine di membrana-curvatura come operare. Questo articolo descrive un protocollo per ricostituire una membrana nanotubi in vitro mediante micromanipolazione, microscopia confocale e pinzette ottiche. L’approccio può essere utilizzato per studiare in modo quantitativo, come proteine, lipidi o piccole molecole interagiscono con le membrane curve. GUV del lipido sono utilizzati come modelli di una membrana cellulare, cui curvatura è trascurabile rispetto alle dimensioni delle molecole interagenti curvatura a membrana. Essi sono preparati utilizzando il metodo di electroformation⁹ in cui le vescicole sono formate da idratante un film lipidico e gonfiore in GUV sotto una corrente alternata (AC)¹⁰. Sono più comuni substrati su cui sono coltivati GUV o semi-conduttori piatti ricoperti di ossido della latta dell’indio (ITO) o fili di platino (Pt-fili)¹¹. In questo lavoro, GUV sono coltivate su Pt-fili come questo metodo ha dimostrato di funzionare molto meglio rispetto all’alternativa nel rendere GUV in presenza di sali nei buffer¹². Anche se il protocollo di electroformation è qui descritto in dettaglio sufficiente per riprodurlo, rimandiamo il lettore ad articoli precedenti in cui simili e altri metodi di fare GUV sono stati descritti in dettaglio^13,14. Nelle nostre mani, electroformation il Pt-fili ha correttamente dato GUV da un mix di lipidi sintetici o da lipidiche naturali estratti in un tampone contenente ~ 100 mM NaCl. Inoltre, era anche possibile incapsulare GUV contiene proteine durante la crescita. Una camera di electroformation esempio è mostrata in Figura 1A; si compone di due ~ 10 cm-lunghezza Pt-fili inserite in un supporto effettuato in politetrafluoroetilene (PTFE) che può essere sigillato su entrambi i lati con lamelle di vetro ~ 1-2 cm di distanza (Figura 1A).

Figura 1: messa a punto sperimentale. (A) il GUV electroformation camera con connettori elettrici collegati ai fili di Pt. Sinistra (B): il sistema sperimentale mostrando il microscopio, la camera sperimentale sopra l’obiettivo e due Micropipette (sinistra e destra) associati ad i micromanipolatori e inseriti nella camera sperimentale per tubo tirando e proteina iniezione. A destra: una vista ravvicinata della camera sperimentale montato sopra l’obiettivo mostrando le punte di aspirazione e le micropipette di iniezione inserite. (C) A siringa dotata di un erogatore sottile inserito in una micropipetta a suo back-end. Il fondo è una vista ravvicinata del dispenser all’interno la micropipetta con la linea tratteggiata blu che delinea la micropipetta. Questo sistema è utilizzato per riempire la micropipetta con caseina per passivare la superficie di vetro e anche per eseguire il riempimento con olio minerale quando necessario. (D) A sistema utilizzato per aspirare quantità µ l della soluzione della proteina. L’ago è collegato ad una siringa e al tubo che è collegato alla micropipetta di iniezione. La punta della micropipetta è accuratamente immerso nella soluzione della proteina e aspirata così per riempire la punta della micropipetta. La micropipetta indietro viene poi riempita con olio minerale, utilizzando il sistema mostrato nel pannello di C. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Un nanotubo di membrana, che vanno nel raggio da 7 a diverse centinaia nm, può essere tirato da un capo da una forza esterna. Questo metodo è stato inizialmente progettato per misurare le proprietà elastiche delle membrane cellulari e vescicole, ad esempio il piegamento rigidità^15,16. Nelle opere più recenti, il metodo è stato esteso per studiare l’interazione delle proteine con membrane curve di microinjecting le proteine vicino il nanotubo tirato^7,17. Altri metodi sono stati sviluppati per lo studio delle proteine di membrana-curvatura. In un unico metodo, proteine vengono incubate con diverse dimensioni liposomi legati ad una superficie passivata. La microscopia confocale è utilizzata per misurare il legame con le proteine in funzione del diametro di liposomi, che può indicare indotta da curvatura ordinamento^18,19. In un altro metodo, proteine vengono iniettate nei pressi di un micro-aspirato GUV per misurare la loro capacità di indurre spontaneamente tubuli^20,21. Il metodo descritto in questo protocollo è in grado di studiare la curvatura a membrana proteine coinvolte nell’endocitosi, dove la maggior parte delle proteine in genere incontrano nanotubi di membrana preformata collegando l’invaginazione della membrana contenenti merci con il fondo piatto della membrana plasmatica. Inoltre, in questo metodo, a differenza nell’analisi con liposomi piccoli tethered, i nanotubi di membrana sono continuamente collegato alla membrana; Pertanto, è in equilibrio meccanico con il capo, una situazione previsto in vivo. Quindi, fisica fondamentale della membrana si applica e si può dedurre una pletora di proprietà meccaniche da nostre misure^22,23,24.

Per una piena attuazione di questo metodo, l’attrezzatura comprende un microscopio confocale, pinzette ottiche e uno o due Micropipette collegate ad un serbatoio di acqua (Figura 1B). Combinando tutti e tre, è possibile misurare la tensione della membrana, membrana della curvatura, densità di superficie delle proteine, e contemporaneamente forza²⁵del tubo. Micropipetta aspirazione è essenziale e facilmente è costruito mediante l’inserimento di una micropipetta di vetro in un supporto collegato ad un serbatoio di acqua, che, tramite pressione idrostatica, controlla la pressione di aspirazione²⁶. La micropipetta e il titolare sono controllati da un micromanipolatore e, idealmente, in una direzione da un attuatore piezoelettrico per il movimento di precisione. Per tirare un nanotubo, la microaspirated GUV brevemente è attaccato ad una perlina micron imprese poi tirata via creando un nanotubo. In questa implementazione, il tallone è detenuto da Pinzetta ottica, che può essere costruita seguendo un protocollo pubblicato²⁷. È possibile fare a meno delle pinzette ottiche e nanotubi di tirare in modi diversi, anche se a costo di misure di forza accurata. Se è troppo difficile da costruire un’ottica trap o se misure di forza sono non essenziali, come se uno vuole semplicemente verificare la preferenza delle proteine per membrane curve, un tubo può essere estratto utilizzando una perlina aspirata all’estremità di una micropipetta secondo²⁸. È anche possibile tirare tubi mediante forza gravitazionale²⁹ o^30,31di flusso. Inoltre, la microscopia confocale è non è essenziale; Tuttavia, si è preferito così per misurare la densità di superficie delle proteine. Permette inoltre di misurare il raggio di nanotubi da intensità di fluorescenza dei lipidi nel tubo, così indipendentemente dalla forza della membrana e la tensione. Raggio del tubo deduzione da fluorescenza è particolarmente importante se il rapporto tra queste quantità si discosta dalle equazioni ben consolidate a causa della presenza di proteine di membrana-aderito²⁵. Cosa importante, uno non può erogare della trappola ottica e microscopia confocale, poichè non è possibile misurare la curvatura del tubo.

Il metodo descritto in questo protocollo è stato utilizzato per studiare l’ordinamento di curvatura-indotta di varie proteine di membrana periferici su nanotubi, soprattutto quelli dalla famiglia^25,BAR^32,33,34 . Inoltre è stato indicato che il canale del potassio del transmembrane conicamente sagomato che KvAP si arricchisce il curvo nanotubi nello stesso modo come BAR proteine³⁵. Grazie all’ottimizzazione del metodo per incapsulare GUV contiene proteine, l’interazione delle proteine con curvatura negativa è stato recentemente studiato come ben³⁶. Inoltre, questo metodo è stato usato per delucidare la formazione di proteina scaffold^25,37 e per studiare il meccanismo di scissione di membrana da entrambi linea tensione³⁸, proteina dinamina³⁹, o da BAR proteine^40,41. Oltre alle proteine, piccole molecole o ioni possono anche indurre la curvatura. Utilizzando questo metodo, gli ioni di calcio sono stati indicati per indurre la curvatura positiva sotto condizioni senza sale⁴². Interessante, ha anche dimostrato che i lipidi possono subire curvatura differenziata, anche se solo per le composizioni che sono vicino a un demixing punto^43,44. In sintesi, il metodo può essere utilizzato dai ricercatori interessati a indagare come entrambi componenti integrali di membrana (ad es., lipidi o proteine transmembrana) o marginalmente associazione molecole (sia all’interno o all’esterno di GUV) interagire con membrane cilindricamente curve, dal punto di vista meccanico e quantitativa. Inoltre è inteso per coloro che sono interessati a misurare le proprietà meccaniche della membrana stessa^22,23,45.

Protocol

1. preparazione del Guv da Electroformation su Pt-fili Pulire la camera di electroformation (Vedi Introduzione e Figura 1A) e i Pt-fili con un solvente organico come etanolo o acetone per lavare via i lipidi e con acqua per lavare via i sali.Nota: Consigliamo di lasciare asciugandosi il residuo con tessuto imbevuto di etanolo prima sonicating in acetone, etanolo, quindi acqua, ciascuno per 5 min. Preparare una miscela di lipidi di una composizione lip…

Representative Results

L’esperimento di tubo-tirando può dare informazioni vitali meccaniche su membrana. In assenza di proteine o altre molecole che forza la coppia con curvatura della membrana, la membrana e raggio del tubo può essere correlato con tensione nelle membrane applicando l’Hamiltoniana di carnevali-Helfrich equazione ad un tubo tirato da un GUV50,51 <img alt="Equation 3" src="…

Discussion

Il metodo di tirare tubi da GUV dà ricco di informazioni sul sistema proteina di membrana, come non è solo il mezzo per misurare le proprietà meccaniche fondamentali della membrana, ma aiuta a far luce sull’accoppiamento tra membrana e proteine curvatura. Come discusso nell’introduzione, esistono altre tecniche per misurare gli effetti delle proteine di membrana-curvatura, o incubando le proteine con liposomi di sub-micron legati a una superficie passivata^{18,19</sup…}

Materials

1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DOPC)	Avanti	850375	Example lipid used in data for Figure 3
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] [DSPE-PEG(2000)-biotin]	Avanti	880129	biotinylated lipid
BODIPY-TR-C5-ceramide	Molecular Probes (ThermoFisher)	D7540	fluorescent lipid
BODIPY- FLC5-hexadecanoyl phosphatidylcholine (HPC*)	Molecular Probes (ThermoFisher)		fluorescent lipid for protein density calibration
egg L-α-phosphatidylcholine (eggPC)	Avanti	840051	used for calibrating the tube radius constant
β-casein from bovine milk (>99%)	Sigma Aldrich	C6905	used for passivating the micropipette and the experimental chamber
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903
D(+) glucose	Sigma Aldrich	G7021
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
Tris	Sigma Aldrich	10708976001
osmometer	Loser	n/a
Pt-wires, 0.5 mm diameter, 99.99% pure	Goodfellow USA	PT005139	used for GUV electroformation
function generator		n/a	used to create current for GUV electroformation
putty sealant	Vitrex (from CML France)	CRIT 140013	used to seal the electroformation chamber
bath sonicator		n/a	useful to clean the electroformation chamber, but not crucial
Nikon TE2000 inverted microscope, eC1 confocal system (Nikon), with two laser lines (λ = 488 nm and 543 nm); optical tweezers induced by a 5 W ytterbium fiber continuous wave laser (λ > 1070 nm; IPG GmBH Germany)			an example of a confocal microscopy system equipped with optical tweezers
micromanipulators		n/a
borosilicate capillaries (with internal and external radii of 0.78 mm and 1 mm, respectively)	Harvard apparatus	30-0036
micropipette puller	Sutter Instrument	P-2100
microforge	Narishige	MF-800
piezoelectric actuator	Physik Instrumente	n/a
polystyrene streptavidin coated beads (diameter 3.2 µm)	Spherotech	SVP-30-5