Tirando de nanotubos de membrana de las vesículas unilaminar gigante

Summary

Muchas proteínas en la célula de sensación e inducen curvatura de la membrana. Se describe un método para nanotubos de membrana de las vesículas de lípidos para el estudio de la interacción de proteínas o cualquier molécula activa de curvatura con membranas curvo in vitro.

Abstract

La remodelación de la membrana celular es una parte integral de muchos fenómenos celulares, como la endocitosis, trata de personas, la formación de filopodios, etcetera. Muchas proteínas diferentes se asocian con membranas curvadas debido a su capacidad para sentir o inducir la curvatura de la membrana. Por lo general, estos procesos implican una multitud de proteínas haciéndolos demasiado complejo para estudiar cuantitativamente en la célula. Se describe un protocolo para la reconstitución de una membrana curvada en vitro, imitando una estructura celular curva, como el cuello endocítico. Una vesícula unilaminar gigante (GUV) se utiliza como un modelo de una membrana celular, cuya presión interna y tensión superficial son controlado con la aspiración de la micropipeta. Aplicación de una fuerza de tracción de punto en el GUV usando pinzas ópticas crea un nanotubo de alta curvatura conectado a una membrana plana. Este método se ha utilizado tradicionalmente para medir las propiedades mecánicas fundamentales de las membranas de lípidos, como la rigidez de flexión. En los últimos años se ha ampliado para estudiar cómo las proteínas interactúan con la curvatura de la membrana y la forma en que afectan la forma y la mecánica de las membranas. Un sistema que combina la micromanipulación, microinyección, pinza óptica y microscopía confocal permite medición de la curvatura de la membrana, membrana tensión y la densidad superficial de las proteínas, al mismo tiempo. De estas mediciones, se pueden deducir muchas propiedades mecánicas y morfológicas importantes sistema de proteínas de la membrana. Además, nos pone a un protocolo de creación 2.fino en presencia de concentraciones fisiológicas de sal y un método de cuantificación de la densidad superficial de las proteínas en la membrana de intensidades de fluorescencia de etiquetado proteínas y lípidos.

Introduction

Muchos procesos celulares, tales como endocitosis, trata de personas, la formación de filopodios, infección, etc., se acompañan de un cambio drástico en la forma de las membranas celulares^1,2. En la célula, una serie de proteínas participa en estos procesos por Unión a la membrana y alterar su forma. Los ejemplos más notables son los miembros de la familia de proteínas Amphiphysin/Bin/Rvs (BAR), que contiene una característica intrínsecamente curvada barra dominio^3,4,5,6,7. Por lo general, interactúan con la membrana adhiriendo el dominio de la barra a la superficie y, en muchos casos, también con insertar anfipáticos hélices en la bicapa. La forma, tamaño y carga del dominio de barra con el número de hélices anfipáticos determina: (1) la dirección de la curvatura de la membrana (es decir, si inducen invaginaciones o salientes) y (2) la magnitud de la membrana curvatura de^5,8. De la nota, aquí curvatura positiva se define como el lado convexo de la membrana curvada, es decir, el bombeo hacia las partículas interactuantes y negativo lo contrario. Por otra parte, los estudios cuantitativos de barra proteínas revelaron que su efecto sobre la membrana depende de un conjunto de parámetros físicos: densidad de proteínas, la tensión de la membrana y forma de membrana (plano versus tubular versus esférica de la superficie forma)⁷. Dependiendo de estos parámetros de la barra las proteínas puede: (1) actuar como sensores de la curvatura de la membrana (2) las membranas de la curva y (3) induzca de la escisión de la membrana⁷.

Debido al número de componentes implicados en la remodelación de la membrana en la célula, estudia los aspectos cuantitativos de los fenómenos, tales como endocitosis, en vivo es extremadamente difícil. In vitro de la reconstitución de componentes mínimos que mímico el curvado de las membranas en la célula proporciona medios para lograr una comprensión mecanicista de proteínas de membrana-curvar como operar. Este artículo describe un protocolo para la reconstitución de una membrana nanotubos en vitro con micromanipulación, microscopía confocal y pinzas ópticas. El enfoque puede utilizarse para estudiar, en forma cuantitativa, como proteínas, lípidos o pequeñas moléculas interactuan con membranas curvadas. 2.fino de lípidos se utiliza como modelos de una membrana celular, cuya curvatura es despreciable en comparación con el tamaño de moléculas de membrana curva interacción. Son preparados utilizando el método de electroformation⁹ en que las vesículas se forman por hidratante una película lipídica y la hinchazón en 2.fino debajo de una corriente alterna (CA)¹⁰. Sustratos más comunes que se cultiva 2.fino son ambos semi-conductivas placas recubiertas con óxido de estaño indio (ITO) o cables de platino (Pt-cables)¹¹. En este trabajo, 2.fino crecen en alambres de Pt como este método se ha demostrado que funciona mucho mejor que la alternativa en la fabricación de 2.fino en presencia de sales en el buffer¹². Aunque el protocolo electroformation se describe aquí en detalle suficiente para reproducirlo, nos referimos al lector a los artículos anteriores en el que se han descrito similares y otros métodos de hacer 2.fino en detalle^13,14. En nuestras manos, electroformation en alambres de Pt ha con éxito dado a 2.fino de una mezcla de lípidos sintéticos o de lípidos naturales extractos en un tampón que contiene ~ 100 mM NaCl. Además, también era posible encapsular proteínas dentro 2.fino durante el crecimiento. Una cámara de electroformation de ejemplo se muestra en la figura 1A; se compone de dos Pt-cables ~ 10 cm de largo insertados en un soporte de politetrafluoroetileno (PTFE) que se puede sellar por ambos lados con vidrio cubreobjetos cm ~ 1-2 apart (figura 1A).

Figura 1: montaje Experimental. (A) la electroformation GUV cámara con conectores eléctricos conectados a los cables de la pinta. Izquierda (B): el sistema experimental que muestra el microscopio, la cámara experimental sobre el objetivo y dos Micropipetas (izquierdos y derecho) conectado a los micromanipuladores e introduce en la cámara experimental para tirar del tubo y la proteína inyección. Derecha: una vista cercana de la cámara experimental montado sobre el objetivo que muestra los extremos de la aspiración y las Micropipetas de inyección insertados. (C) A la jeringa equipada con un distribuidor delgado insertado en una micropipeta en su extremo posterior. El fondo es una vista cercana de la cubeta dentro de la micropipeta con la línea de puntos azul que la micropipeta. Este sistema se utiliza para llenar la micropipeta con caseína a apaciguar la superficie de vidrio y también para llenar con aceite mineral cuando sea necesario. (D) A sistema usado para aspirar cantidades μl de la solución de proteína. La aguja está conectada a una jeringa y tubo que está conectado con la micropipeta de inyección. La punta de la micropipeta es inmerso en la solución de proteína y aspira así para llenar la punta de la micropipeta. La micropipeta es entonces volver llenos de aceite mineral con el sistema se muestra en el panel C. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Un nanotubo de membrana, que se extienden en un radio de 7 nm a varios cientos nm, se puede tirar de un GUV por una fuerza externa. Este método fue inicialmente diseñado para medir las propiedades elásticas de las membranas celulares y de las vesículas, como la flexión rigidez^15,16. En obras más recientes, el método se amplió para estudiar la interacción de proteínas con membranas curvadas por microinjecting las proteínas cerca el nanotubo tirado^7,17. Otros métodos han sido desarrollados para el estudio de las proteínas de membrana curva. En uno de los métodos, las proteínas se incuban con liposomas de diferentes tamaños anclados a una superficie pasivada. La microscopia confocal se utiliza para medir la Unión a proteínas en función del diámetro de liposomas, que puede indicar curvatura inducida clasificación^18,19. En otro método, se inyectan proteínas cerca un GUV micro aspirado para medir su capacidad de inducir espontáneamente túbulos^20,21. El método descrito en el presente Protocolo está especialmente preparado para estudiar la curvatura de la membrana proteínas implicadas en la endocitosis, donde la mayoría de las proteínas normalmente con nanotubos de membrana preformada conectando la invaginación de la membrana que contiene la carga con el membrana de plasma plana subyacente. Además, en este método, a diferencia de en el ensayo con liposomas pequeño atados, los nanotubos de membrana está continuamente conectado a la membrana; por lo tanto, está en equilibrio mecánico con el GUV, una situación esperada en vivo. Por lo tanto, se aplica la física de la membrana fundamental y podemos inferir una plétora de propiedades mecánicas de nuestras medidas^22,23,24.

Para una plena aplicación de este método, el equipo necesario incluye un microscopio confocal, pinzas ópticas y una o dos Micropipetas conectadas a un tanque de agua (figura 1B). Combinando los tres, es posible medir la tensión de la membrana, membrana curvatura, densidad superficial de las proteínas, y simultáneamente tubo fuerza de²⁵. Aspiración de la micropipeta es esencial y fácilmente se construye insertando una micropipeta de vidrio en un soporte conectado a un tanque de agua, que, a través de la presión hidrostática, controla la presión de aspiración²⁶. La micropipeta y el soporte son controlados por un micromanipulador e, idealmente, en una dirección por un actuador piezoeléctrico para el movimiento de precisión. Para tirar un nanotubo, en microaspirated GUV brevemente se pega a un micrón de tamaño grano entonces tiró lejos creando un nanotubo. En esta implementación, el grano se lleva a cabo por pinzas ópticas, que pueden construirse siguiendo un protocolo publicado²⁷. Es posible obtener de las pinzas ópticas y nanotubos de tirar de diferentes formas, aunque a costa de medidas de fuerza precisa. Si es demasiado difícil para construir una trampa óptica o si las medidas de fuerza son no esenciales, tales como si uno simplemente quiere ver la preferencia de las proteínas de membranas curvadas, se puede tirar un tubo usando un grano aspirado en la punta de una segunda micropipeta²⁸. También es posible tirar los tubos utilizando fuerza gravitacional²⁹ o^30,31de flujo. Además, la microscopia confocal no es esencial sin embargo, es preferido por lo tanto para medir la densidad superficial de las proteínas. También permite medir el radio de nanotubo de intensidad de fluorescencia de los lípidos en el tubo, por lo tanto independientemente de la fuerza de la membrana y la tensión. Inferencia radio tubo de fluorescencia es particularmente importante si la relación entre estas cantidades se desvía de las ecuaciones bien establecidas debido a la presencia de proteínas de membrana adherida²⁵. Lo importante, uno no puede dispensar de la trampa óptica y microscopia confocal, ya que no será posible medir la curvatura del tubo.

El método descripto en este protocolo se ha utilizado para estudiar la curvatura inducida por clasificación de diversas proteínas de membrana periférica en nanotubos, sobre todo los de la barra familiar^25,32,33,34 . También fue demostrado que el canal de potasio transmembrana formados cónicamente en que kvap se enriquece curva nanotubos de la misma manera como la barra de proteínas³⁵. Optimizando el método para encapsular proteínas dentro 2.fino, la interacción de proteínas con curvatura negativa ha sido recientemente investigada bien³⁶. Además, este método ha sido utilizado para dilucidar la formación de proteína andamios^25,37 y estudiar el mecanismo de la escisión de la membrana por cada línea tensión³⁸, proteína Dinamina³⁹, o por la barra de proteínas^40,41. Además de proteínas, moléculas pequeñas o iones también pueden inducir la curvatura. Usando este método, los iones de calcio mostraron inducen curvatura positiva bajo condiciones libres de sal⁴². Curiosamente, también se ha demostrado que los lípidos pueden sufrir curvatura clasificación, aunque sólo para las composiciones que están cerca de un punto demixing^43,44. En suma, el método puede ser utilizado por investigadores interesados en la investigación de cómo cualquiera de los dos componentes de la membrana integral (por ejemplo, los lípidos o las proteínas transmembranales) o periféricamente vinculante moléculas (ya sea dentro o fuera de 2.fino) interactuar con membranas cilíndrico curvadas, desde el punto de vista mecánico y cuantitativo. También está diseñado para aquellos interesados en la medición de las propiedades mecánicas de la membrana sí mismo^22,23,45.

Protocol

1. preparación de 2.fino por Electroformation en los cables de la pinta Limpiar la cámara de electroformation (ver Introducción y figura 1A) y Pt-alambres con un disolvente orgánico como etanol o acetona para eliminar los lípidos y con agua para lavar las sales.Nota: Le sugerimos fondo enjugando el residuo con tejido impregnado de etanol entonces sonicando en acetona, etanol, agua, cada 5 minutos. Preparar una mezcla de lípidos de una composici?…

Representative Results

El experimento de tirar tubo puede dar información vital mecánica sobre la membrana. En la ausencia de proteínas u otras moléculas que la fuerza de la pareja con la curvatura de la membrana, la membrana y radio del tubo puede tener relación con la tensión de membrana aplicando el hamiltoniano Canham-Helfrich ecuación a un tubo tiró de un GUV50,51 <img alt="Equat…

Discussion

El método de tirar tubos de 2.fino proporciona rica información sobre el sistema de la proteína de la membrana, no sólo los medios para medir las propiedades mecánicas fundamentales de la membrana, pero ayuda a arrojar luz sobre el acoplamiento entre las proteínas y membrana curvatura. Como comentamos en la introducción, existen otras técnicas para medir los efectos de las proteínas de membrana curva, incubando las proteínas con liposomas de sub-micron anclados a una superficie pasivada^18</sup…

Materials

1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DOPC)	Avanti	850375	Example lipid used in data for Figure 3
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] [DSPE-PEG(2000)-biotin]	Avanti	880129	biotinylated lipid
BODIPY-TR-C5-ceramide	Molecular Probes (ThermoFisher)	D7540	fluorescent lipid
BODIPY- FLC5-hexadecanoyl phosphatidylcholine (HPC*)	Molecular Probes (ThermoFisher)		fluorescent lipid for protein density calibration
egg L-α-phosphatidylcholine (eggPC)	Avanti	840051	used for calibrating the tube radius constant
β-casein from bovine milk (>99%)	Sigma Aldrich	C6905	used for passivating the micropipette and the experimental chamber
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903
D(+) glucose	Sigma Aldrich	G7021
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
Tris	Sigma Aldrich	10708976001
osmometer	Loser	n/a
Pt-wires, 0.5 mm diameter, 99.99% pure	Goodfellow USA	PT005139	used for GUV electroformation
function generator		n/a	used to create current for GUV electroformation
putty sealant	Vitrex (from CML France)	CRIT 140013	used to seal the electroformation chamber
bath sonicator		n/a	useful to clean the electroformation chamber, but not crucial
Nikon TE2000 inverted microscope, eC1 confocal system (Nikon), with two laser lines (λ = 488 nm and 543 nm); optical tweezers induced by a 5 W ytterbium fiber continuous wave laser (λ > 1070 nm; IPG GmBH Germany)			an example of a confocal microscopy system equipped with optical tweezers
micromanipulators		n/a
borosilicate capillaries (with internal and external radii of 0.78 mm and 1 mm, respectively)	Harvard apparatus	30-0036
micropipette puller	Sutter Instrument	P-2100
microforge	Narishige	MF-800
piezoelectric actuator	Physik Instrumente	n/a
polystyrene streptavidin coated beads (diameter 3.2 µm)	Spherotech	SVP-30-5