Puxando a membrana nanotubos de vesículas Unilamellar gigante

Summary

Muitas proteínas na célula sentem e induzem a curvatura da membrana. Nós descrevemos um método para puxar a membrana nanotubos de vesículas lipídicas para estudar a interação de proteínas ou qualquer molécula de curvatura-ativo com membranas curvo em vitro.

Abstract

A reformulação da membrana celular é parte integrante de muitos fenômenos celulares, tais como endocitose, tráfico, formação de filopodia, etc. Muitas proteínas diferentes associam com membranas curvadas por causa de sua capacidade de sentir ou induzir a curvatura da membrana. Normalmente, esses processos envolvem uma infinidade de proteínas, tornando-os muito complexa para estudar quantitativamente na célula. Descreveremos um protocolo para reconstituir uma membrana curva em vitro, imitando uma curvada estrutura celular, tais como o pescoço endocítica. Uma vesícula unilamellar gigante (GUV) é usada como um modelo de uma membrana celular, cuja pressão interna e a tensão superficial é controlado com aspiração micropipeta. Aplicando uma força puxando do ponto sobre o chefe usando a Pinça óptica cria um nanotubo de curvatura alta ligada a uma membrana plana. Este método tem sido tradicionalmente usado para medir as propriedades mecânicas fundamentais das membranas de lipídios, tais como rigidez de flexão. Nos últimos anos, tem sido expandido para estudar como as proteínas interagem com a curvatura da membrana e a forma como elas afetam a forma e a mecânica das membranas. Um sistema que combina micromanipulação, microinjeção, pinça óptica e microscopia confocal permite a medição da curvatura da membrana, tensão de membrana e a densidade da superfície das proteínas, simultaneamente. Partir destas medições, muitas propriedades mecânicas e morfológicas importantes do sistema de membrana-proteína podem ser inferidas. Além disso, podemos esquematizar um protocolo de criação de GUVs na presença de concentração de sal fisiológica e um método de quantificar a densidade da superfície das proteínas na membrana de intensidades de fluorescência de rotulada de proteínas e lipídios.

Introduction

Muitos processos celulares, tais como endocitose, tráfico, formação de filopodia, infecção, etc, são acompanhados por uma mudança dramática na forma de membranas celulares,^1,2. Na célula, um número de proteínas participar nestes processos vinculando à membrana e alterando sua forma. Os exemplos mais notáveis são membros da família de proteínas de Rvs/Bin/Amphiphysin (BAR), que contém uma característica intrinsecamente curvada BAR domínio^3,4,5,6,7. Normalmente, eles interagem com a membrana, aderindo o domínio de BAR para a superfície e, em muitos casos, também superficialmente, inserindo anfifílicos hélices a BICAMADA. Determina a forma, tamanho e carga do domínio do BAR, juntamente com o número de hélices de anfifílicos: (1) a direção da curvatura de membrana (ou seja, se eles irão induzir invaginações ou saliências) e (2) a magnitude da membrana curvatura de^5,8. Digno de nota, aqui curvatura positiva é definida como o lado convexo da membrana curvada, ou seja, bulge em direção a interação das partículas e negativo caso contrário. Além disso, estudos quantitativos do BAR proteínas revelaram que seu efeito na membrana depende de um conjunto de parâmetros físicos: densidade de tensão de membrana, proteínas e forma de membrana (plana contra tubular contra esférico de superfície forma)⁷. Dependendo desses parâmetros barra de proteínas pode: (1) atuam como sensores de curvatura da membrana, (2) Dobre as membranas ou (3) induzir a membrana cisão⁷.

Devido o grande número de componentes envolvidos na remodelagem de membrana na célula, estudando os aspectos quantitativos dos fenómenos, tais como endocitose, na vivo é extremamente desafiador. In vitro a reconstituição dos componentes mínimos imitando curvas membranas na célula fornece meios para ganhar uma compreensão mecanicista das proteínas de membrana-curvar como operar. Este artigo descreve um protocolo para reconstituir uma membrana nanotubo em vitro usando micromanipulação, microscopia confocal e pinça óptica. A abordagem pode ser usada para estudar, de forma quantitativa, como proteínas, lipídios ou pequenas moléculas interagem com as membranas curvas. GUVs de lipídios são usados como modelos de uma membrana celular, cuja curvatura é insignificante em comparação com o tamanho das moléculas da membrana-curvando-se interagindo. Eles estão preparados usando o método electroformation⁹ em que as vesículas são formadas por um filme lipídico de hidratação e inchaço em GUVs sob uma corrente alternada (AC)¹⁰. Substratos mais comuns em que são cultivadas GUVs são também placas semi condutoras revestidas com óxido da lata do indium (ITO) ou fios de platina (Pt-fios)¹¹. Neste trabalho, GUVs são cultivadas na Pt-fios como esse método foi demonstrado funcionar muito melhor do que a alternativa em fazer GUVs na presença de sais na reserva¹². Embora o protocolo de electroformation é descrito aqui em detalhes suficientes para reproduzi-lo, nos referimos o leitor para artigos anteriores em que semelhantes e outros métodos de fazer GUVs têm sido descritos em detalhe^13,14. Em nossas mãos, electroformation em Pt-fios com sucesso rendeu GUVs partir de uma mistura de lipídeos sintéticos ou lipídica natural extratos em um buffer que contém ~ 100 mM NaCl. Além disso, foi possível também encapsular as proteínas dentro de GUVs durante o crescimento. Uma câmara de electroformation exemplo é mostrada na figura 1A; é composto por dois ~ 10 cm de comprimento Pt-fios, inseridos em um suporte feito de politetrafluoretileno (PTFE) que pode ser selado em ambos os lados com as lamelas de vidro ~ 1-2 cm de distância (figura 1A).

Figura 1: configuração Experimental. (A), o chefe electroformation câmara com conectores elétricos, ligado ao Pt-fios. (B) à esquerda: o sistema experimental mostrando o microscópio, câmara experimental acima o objetivo e duas micropipetas (esquerdas e direita) anexado para os Micromanipuladores e inserido na câmara experimental para tubo puxando e proteína injeção. Direito: uma visão mais apurada da câmara experimental montado acima o objetivo de mostrar as dicas da aspiração e as Micropipetas de injeção inseridas. (C) A seringa equipada com um distribuidor fino inserido uma micropipeta no seu back-end. O fundo é uma close-up vista do distribuidor no interior da micropipeta com linha pontilhada azul delineando a micropipeta. Este sistema é usado para preencher a micropipeta com caseína passivate a superfície do vidro e também para voltar a enchê-lo com óleo mineral, quando necessário. (D), um sistema usado para aspirar quantidades µ l da solução da proteína. A agulha é conectada a uma seringa e a tubulação que é conectada à micropipeta de injeção. A ponta da micropipeta cuidadosamente é imerso na solução da proteína e então aspirada para preencher a ponta da micropipeta. A micropipeta é então volta preenchida com óleo mineral, utilizando o sistema mostrado no painel C. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Um nanotubo de membrana, variando no raio de 7 nm a várias centenas de nm, pode ser retirado um chefe por uma força externa. Esse método foi inicialmente projetado para medir as propriedades elásticas das membranas celulares e vesículas, tais como a flexão rigidez^15,16. Em trabalhos mais recentes, o método foi estendido para estudar a interação das proteínas com membranas curvas por microinjecting as proteínas perto do nanotubo puxada^7,17. Outros métodos foram desenvolvidos para o estudo de proteínas de membrana-curvando-se. Em um método, as proteínas são incubadas com lipossomas de diferente tamanhos amarrados a uma superfície passivada. Microscopia confocal é usada para medir o emperramento da proteína em função do diâmetro de lipossomas, que pode indicar induzida por curvatura classificação^18,19. Em outro método, as proteínas são injetadas perto de um chefe de microaspirado para medir sua capacidade de induzir espontaneamente túbulos^20,21. O método descrito neste protocolo é especialmente adequado para estudar o encurvamento da membrana proteínas envolvidas na endocitose, onde a maioria das proteínas normalmente encontram pré-formadas membrana nanotubos conectando a invaginação da membrana contendo carga com o membrana de plasma plana subjacente. Além disso, neste método, ao contrário no ensaio com lipossomas pequenos amarrados, o nanotubo de membrana está continuamente ligado à membrana; Portanto, é no equilíbrio mecânico com o chefe, uma situação esperada na vivo. Por isso, fundamental membrana física aplica-se e podemos inferir uma infinidade de propriedades mecânicas de nossas medições^22,23,24.

Para uma plena implementação deste método, o equipamento necessário inclui um microscópio confocal, pinça óptica e uma ou duas micropipetas conectadas a um tanque de água (figura 1B). Combinando todos os três, é possível medir a tensão de membrana, curvatura de membrana, densidade de superfície das proteínas e simultaneamente tubo de força²⁵. Micropipeta de aspiração é essencial e é facilmente construído através da inserção de uma micropipeta de vidro em um suporte ligado a um tanque de água, que, através de pressão hidrostática, controla a pressão de aspiração²⁶. A micropipeta e o titular são controlados por um micromanipulador e, idealmente, em uma direção por um piezo-atuador para movimento de precisão. Para puxar um nanotubo, o microaspirated chefe é brevemente preso a um mícron de tamanho do grânulo então puxou embora criando um nanotubo. Nesta implementação, o grânulo é realizado pela Pinça óptica, que pode ser construída seguindo um protocolo publicado²⁷. É possível dispensar da pinça óptica e puxar nanotubos de maneiras diferentes, embora à custa de medições precisas de força. Se é muito difícil construir uma armadilha óptica ou se as medições de força são não essenciais, como se você simplesmente quiser verificar a preferência de proteínas por membranas curvas, um tubo pode ser puxado usando um grânulo aspirado na ponta de um segundo micropipeta²⁸. Também é possível puxar os tubos usando força gravitacional²⁹ ou^30,31de fluxo. Além disso, a microscopia confocal também não é essencial; no entanto, é tão preferido para medir a densidade da superfície de proteínas. Também permite medir o raio de nanotubo de intensidade de fluorescência de lipídios no tubo, assim, independentemente da membrana força e tensão. Raio de tubo inferindo da fluorescência é particularmente importante se a relação entre essas quantidades afasta-se das equações bem estabelecidas, devido à presença de proteínas de membrana se adere²⁵. Importante, um não pode dispensar da armadilha óptica e microscopia confocal, pois não será possível medir a curvatura do tubo.

O método conforme descrito neste protocolo tem sido usado para estudar a classificação induzida em curvatura de várias proteínas de membrana periférica em nanotubos, principalmente aqueles do BAR família^25,32,33,34 . Também foi demonstrado que o canal de potássio transmembrana cònicamente em forma em que kvap é enriquecida curvo nanotubos da mesma forma como BAR proteínas³⁵. Otimizando o método para encapsular as proteínas dentro de GUVs, a interação das proteínas com curvatura negativa foi investigada recentemente como bem³⁶. Além disso, este método tem sido usado para elucidar a formação de proteína andaimes^25,37 e estudar o mecanismo de cisão de membrana por qualquer linha tensão³⁸, proteína Dinamina³⁹, ou BAR proteínas^40,,⁴¹. Além de proteínas, pequenas moléculas ou íons podem também induzir a curvatura. Usando esse método, os íons de cálcio foram mostrados para induzir a curvatura positiva sob condições sem sal⁴². Curiosamente, ele também foi mostrado que lipídios podem sofrer curvatura classificação, embora somente para composições que estão perto de um demixing ponto^43,44. Em suma, o método pode ser usado por pesquisadores interessados em investigar ou como componentes de integral de membrana (por exemplo, lipídios ou proteínas transmembrana) ou vinculação perifericamente moléculas (seja dentro ou fora GUVs) interagir com membranas cilindricamente curvas, do ponto de vista mecânico e quantitativo. Também se destina para aqueles interessados em medir as propriedades mecânicas da membrana em si^22,23,45.

Protocol

1. preparação de GUVs por Electroformation na Pt-fios Limpe a câmara de electroformation (ver introdução e figura 1A) e os Pt-fios com um solvente orgânico como etanol ou acetona para lavar os lipídios e com água para lavar os sais.Nota: Sugerimos cuidadosamente enxugando o resíduo com tecido embebido em álcool etílico, em seguida, sonicating em acetona, etanol e água, cada um por 5 min. Prepare uma mistura de lipídios de uma composição…

Representative Results

O experimento de puxar o tubo pode dar informações vitais de mecânicas sobre a membrana. Na ausência de proteínas ou outras moléculas que força a par com a curvatura da membrana, a membrana e o raio do tubo pode estar relacionado com a tensão de membrana aplicando o hamiltoniano Canham-Helfrich equação para um tubo retirado um chefe50,51 <img alt="Equation 3" …

Discussion

O método de puxar os tubos de GUVs dá a rica informação sobre o sistema de membrana-proteína, como não é apenas o meio para medir as propriedades mecânicas fundamentais da membrana, mas ajuda a lançar luz sobre o acoplamento entre proteínas e membrana curvatura. Como discutido na introdução, outras técnicas existem para medir os efeitos das proteínas de membrana-encurvamento, incubando-se as proteínas com lipossomas de submícron, amarrados a uma superfície passivadas^18,…

Materials

1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DOPC)	Avanti	850375	Example lipid used in data for Figure 3
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] [DSPE-PEG(2000)-biotin]	Avanti	880129	biotinylated lipid
BODIPY-TR-C5-ceramide	Molecular Probes (ThermoFisher)	D7540	fluorescent lipid
BODIPY- FLC5-hexadecanoyl phosphatidylcholine (HPC*)	Molecular Probes (ThermoFisher)		fluorescent lipid for protein density calibration
egg L-α-phosphatidylcholine (eggPC)	Avanti	840051	used for calibrating the tube radius constant
β-casein from bovine milk (>99%)	Sigma Aldrich	C6905	used for passivating the micropipette and the experimental chamber
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903
D(+) glucose	Sigma Aldrich	G7021
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
Tris	Sigma Aldrich	10708976001
osmometer	Loser	n/a
Pt-wires, 0.5 mm diameter, 99.99% pure	Goodfellow USA	PT005139	used for GUV electroformation
function generator		n/a	used to create current for GUV electroformation
putty sealant	Vitrex (from CML France)	CRIT 140013	used to seal the electroformation chamber
bath sonicator		n/a	useful to clean the electroformation chamber, but not crucial
Nikon TE2000 inverted microscope, eC1 confocal system (Nikon), with two laser lines (λ = 488 nm and 543 nm); optical tweezers induced by a 5 W ytterbium fiber continuous wave laser (λ > 1070 nm; IPG GmBH Germany)			an example of a confocal microscopy system equipped with optical tweezers
micromanipulators		n/a
borosilicate capillaries (with internal and external radii of 0.78 mm and 1 mm, respectively)	Harvard apparatus	30-0036
micropipette puller	Sutter Instrument	P-2100
microforge	Narishige	MF-800
piezoelectric actuator	Physik Instrumente	n/a
polystyrene streptavidin coated beads (diameter 3.2 µm)	Spherotech	SVP-30-5