Trekke membran nanorør fra gigantiske Unilamellar blemmer

Summary

Mange proteiner i cellen forstand og indusere membran kurvatur. Vi beskriver en metode for å trekke membran nanorør fra lipid blemmer å studere samspillet av proteiner eller et kurvatur-aktiv molekyl med buet membraner i vitro.

Abstract

Omforming av cellemembranen er en integrert del av mange mobilnettet fenomener, som endocytose, menneskehandel, dannelsen av filopodia, etc. Mange ulike proteiner knytte buet membraner på grunn av deres evne til å forstand eller indusere membran kurvatur. Vanligvis innebærer disse prosessene en rekke proteiner gjør dem for komplisert å studere kvantitativt i cellen. Vi beskriver en protokoll for å gjeninnføre en buet membran i vitro, etterligne en buet cellestruktur, som endocytic halsen. En gigantisk unilamellar vesicle (GUV) brukes som en modell av en celle membran, som intern trykk og overflatespenning kontrolleres med brønnene aspirasjon. Bruk et punkt trekke kraft på GUV ved hjelp av optisk pinsett oppretter en nanotube høy svingtype koblet til en flat membran. Denne metoden er tradisjonelt brukt til å måle de grunnleggende mekaniske egenskapene av lipid membraner, for eksempel bøying stivhet. De siste årene, har den blitt utvidet til å studere hvordan proteiner sammen med membran kurvatur og hvordan de påvirker formen og mekanikken i membraner. Systemet kombinerer micromanipulation, microinjection, optisk pinsett og AC confocal mikroskopi tillater måling av membran kurvatur, membran spenning og overflate tettheten av proteiner, samtidig. Fra disse målingene, kan mange viktige mekanisk og morfologiske egenskaper av protein-membranen utledes. I tillegg legger vi ut en protokoll for å skape GUVs i nærvær av fysiologiske saltkonsentrasjon, og en metode for å kvantifisere overflaten tettheten av proteiner på membranen fra fluorescens intensiteter etiketter proteiner og lipider.

Introduction

Mange mobilnettet prosesser, for eksempel endocytose, menneskehandel, dannelsen av filopodia, infeksjon, etc., er ledsaget av en dramatisk endring i form av celle membraner^1,2. I cellen delta en rekke proteiner i disse prosessene ved binding til membranen og endre fasongen. De mest kjente eksemplene er medlemmer av Bin/Amphiphysin/Rvs (BAR) protein familien, som inneholder en karakteristisk egentlig buet BAR domene,^3,,^4,,^5,,^6,,⁷. Vanligvis samhandler de med membran ved å følge BAR domenet til overflaten, og i mange tilfeller også lav å sette inn amphipathic helikser i bilayer. Form, størrelse og kostnad på BAR domenet og antall amphipathic helikser bestemmer: (1) retning av membran kurvatur (dvsom de vil indusere invaginations eller utstikkende deler), og (2) omfanget av membran kurvatur^5,8. Av notatet, er her positiv kurvatur definert som den konvekse siden buet membranen, dvs, bule mot samspill partikkelen, og negative ellers. Videre kvantitative studier av BAR proteiner avdekket at deres effekt på membranen er avhengig av en rekke fysiske parametere: overflaten tettheten av proteiner, membran spenning og membran form (flat versus rørformede versus sfærisk figur)⁷. Avhengig av parameterne BAR proteiner kan: (1) fungere som sensorer membran kurvatur (2) bøye membraner og (3) induserer membran scission⁷.

På grunn av det store antallet komponenter involvert i membranen omforming i cellen, studere kvantitative aspekter av fenomener, som endocytose, er i vivo ekstremt utfordrende. In vitro rekonstituering minimal komponenter mimicking buet membraner i cellen gir midler til å få en mekanistisk forståelse av hvordan membran-buede proteiner operere. Denne artikkelen beskriver en protokoll for å gjeninnføre en membran nanotube i vitro micromanipulation, AC confocal mikroskopi og optisk pinsett. Tilnærming kan brukes til å studere, i en kvantitativ måte, hvordan proteiner og lipider små molekyler samhandle med buet membraner. Lipid GUVs brukes som modeller av en celle membran, der kurven er ubetydelig i forhold til størrelsen på samspill membran-buede molekyler. De er forberedt bruker electroformation metoden⁹ som blemmer er dannet av fuktighetsgivende en lipid film og hevelse det i GUVs under en vekselstrøm (AC)¹⁰. De vanligste substratene som GUVs er vokst er enten semi ledende platene belagt med indium tinn oksid (ITO) eller platina ledninger (Pt-ledninger)¹¹. I dette arbeidet, er GUVs dyrket på Pt-ledninger som denne metoden har vist seg å fungere mye bedre enn alternativet å GUVs i nærvær av salter i bufferen¹². Selv om electroformation protokollen er beskrevet her i tilstrekkelig detalj å gjengi den, henvise vi leseren til tidligere artikler som lignende metoder for å lage GUVs har blitt beskrevet i detalj^13,14. I våre hender, har electroformation på Pt-ledninger ble gitt GUVs fra en blanding av syntetisk lipider eller naturlig lipid ekstrakter i en buffer som inneholder ~ 100 mM NaCl. Videre var det også mulig å innkapsle proteiner i GUVs under vekst. Et eksempel electroformation kammeret er vist i figur 1A; Den består av to ~ 10 cm lang Pt-ledninger settes inn i en holder laget av polytetrafluoroethylene (PTFE) som kan forsegles på begge sider med glass coverslips ~ 1-2 cm fra hverandre (figur 1A).

Figur 1: eksperimentelle oppsett. (A) GUV electroformation kammeret elektriske kontakter knyttet til Pt-ledninger. (B) venstre: eksperimentell systemet viser mikroskopet, eksperimentelle kammeret over målet og to Mikropipetter (venstre og høyre) knyttet til micromanipulators og settes inn i det eksperimentelle kammeret for rør trekke og protein injeksjon. Høyre: et nærbilde av eksperimentelle kammeret montert over målsettingen viser tips av aspirasjon og injeksjon Mikropipetter satt inn. (C) en sprøyte utstyrt med en tynn dispenser inn brønnene på baksiden slutten. Bunnen er et nærbilde av dispenser i brønnene med blå stiplet linje disponering av brønnene. Dette systemet brukes til å fylle brønnene med kasein å passivate glassoverflaten og tilbake fyll med mineralolje ved behov. (D) en systemet brukes inneholder µL mengder protein løsningen. Nålen er koblet til en sprøyte og rør som er koblet til injeksjon brønnene. Brønnene spissen er nøye nedsenket i protein løsningen og pustende så for å fylle brønnene spissen. Brønnene er så tilbake fylt med mineralolje bruker systemet vist i panel C. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

En membran nanotube, alt i radius fra 7 nm å flere hundre nm, kan trekkes fra en GUV med en ekstern makt. Denne metoden ble først utviklet for å måle elastiske egenskaper for celle membraner og blemmer, for eksempel bøying stivhet^15,16. I de siste verk, ble metoden utvidet til å studere samspillet av proteiner med buet membraner av microinjecting proteiner nær de trakk nanotube^7,17. Andre metoder har blitt utviklet for å studere membran-buede proteiner. I en metode, er proteiner ruges med annerledes størrelse liposomer bundet til en paddivert overflate. AC confocal mikroskopi brukes til å måle protein bindingen som en funksjon av liposome diameter, som kan angi kurvatur-indusert sortering^18,19. I en annen metode, er proteiner injisert nær en mikro pustende GUV å måle evnen til å indusere spontant tubuli^20,21. Metoden beskrevet i denne protokollen er unikt tilpasset å studere membran-buede proteiner involvert i endocytose, hvor de fleste proteiner vanligvis møter preformed membran nanorør koble Last inneholder membran invagination med den underliggende flatskjerm plasma membran. Videre i denne metoden, er i motsetning til i analysen med bundet liten liposomer, membran nanotube kontinuerlig koblet til membranen; Derfor er det i mekanisk likevekt med GUV, en situasjon som forventet i vivo. Derfor grunnleggende membran fysikk gjelder og vi kan antyde en overflod av mekaniske egenskaper fra våre målinger^22,23,24.

For en full implementering av denne metoden inkluderer nødvendig utstyr AC confocal mikroskop, optisk pinsett og en eller to Mikropipetter koblet til en vanntank (figur 1B). Ved å kombinere alle tre, er det mulig å samtidig måle membran spenning, membran kurvatur, overflate tetthet av proteiner, og rør force²⁵. Brønnene aspirasjon er viktig og det er enkelt konstruert ved å sette inn glass brønnene i en holder som er koblet til en vanntank, som via hydrostatisk trykk, kontrollerer aspirasjon press²⁶. Brønnene og holder, kontrolleres av en micromanipulator, og helst i én retning av en piezo-aktuator for presisjon bevegelse. Trekke en nanotube, er microaspirated GUV kort fast en mikron-størrelse perle deretter trakk skape en nanotube. I denne implementeringen holdes perlen av optisk pinsetter, som kan konstrueres ved å følge en publisert protokollen²⁷. Det er mulig å dispensere optisk pinsett og trekke nanorør på forskjellige måter, men på bekostning av nøyaktig force målinger. Hvis det er for vanskelig å bygge en optisk felle eller hvis makt målingene er ikke avgjørende, som hvis man bare ønsker du foretrekker proteiner buet membraner, kan en tube trekkes bruker en perle pustende på spissen av en andre brønnene²⁸. Det er også mulig å trekke rør med gravitasjonskraft²⁹ eller flyte^30,31. Videre er AC confocal mikroskopi ikke avgjørende enten; Imidlertid er det foretrukket så å måle overflate tettheten av proteiner. Det kan også måle nanotube radius fra fluorescens intensiteten av lipider i røret, dermed uavhengig av membran kraft og spenning. Inferring tube radius fra fluorescens er spesielt viktig hvis forholdet mellom disse antallene avviker fra veletablerte ligninger på grunn av tilstedeværelsen av membran-overholdt proteiner²⁵. Viktigere, dispensere ikke en av både optisk felle og AC confocal mikroskopi, som det ikke vil være mulig å måle ryggsøylens rør.

Metoden som beskrevet i denne protokollen er brukt til å studere kurvatur-indusert sorteringen av ytre membran på nanorør, hovedsakelig de den BAR familie^25,32,33,34 . Det ble også vist at conically formet transmembrane kalium kanalen KvAP er anriket på buet nanorør på samme måte som BAR proteiner³⁵. Ved å optimalisere metoden for å innkapsle proteiner i GUVs, har samspillet av proteiner med negative kurvatur nylig blitt undersøkt som godt³⁶. Videre, denne metoden er brukt å belyse dannelsen av protein stillaser^25,37 og studere mekanismen av membran scission enten linje spenning³⁸, protein dynamin³⁹, eller BAR proteiner^40,41. I tillegg til proteiner, kan små molekyler eller ioner også indusere kurvatur. Bruker denne metoden, ble kalsiumioner vist å indusere positiv kurvatur under salt-fri forhold⁴². Interessant, har det også vist at lipider kan gjennomgå kurvatur sortering, men bare for komposisjoner som er nær en demixing punkt^43,44. I sum, metoden kan brukes av forskere interessert i å undersøke hvordan enten integrert membran komponenter (f.eks, lipider eller transmembrane proteiner) eller perifert bindende molekyler (enten innenfor eller utenfor GUVs) samhandle med cylindrically buet membraner, fra mekanisk eller kvantitativ synsvinkler. Det er også ment for interesserte i å måle de mekaniske egenskapene av membranen selv^22,23,45.

Protocol

1. forberedelse av GUVs av Electroformation på Pt-ledninger Rengjøre electroformation kammeret (se introduksjon og figur 1A) og Pt-ledninger med en organisk løsemiddel som etanol eller aceton å vaske bort av lipider og med vann å vaske bort salter.Merk: Vi anbefaler grundig tørke bort resten med etanol-gjennomvåt vev og sonicating i aceton, etanol og vann, for 5 min. Forberede en lipid blanding av en ønsket lipid komposisjon ved 1 mg/mL i klor…

Representative Results

Rør-rykk eksperimentet kan gi viktig mekanisk informasjon om membranen. I fravær av proteiner eller andre molekyler som par med membran kurvatur, membranen tvinge og rør radius kan relateres med membran spenning ved å bruke Canham-Helfrich Hamiltonian ligningen slik trakk fra en GUV50,51 (For…

Discussion

Metoden trekke rør fra GUVs gir rik informasjon på membran-protein systemet, som det er ikke bare betyr å måle de grunnleggende mekaniske egenskapene av membranen, men det hjelper for å belyse koblingen mellom proteiner og membran kurvatur. Som omtalt i innledningen, andre teknikker finnes for å måle effekten av membran-buede proteiner, ved rugende proteiner med sub-mikron liposomer bundet til en paddivert overflate^18,19 eller observere den spontan formasj…

Materials

1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DOPC)	Avanti	850375	Example lipid used in data for Figure 3
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] [DSPE-PEG(2000)-biotin]	Avanti	880129	biotinylated lipid
BODIPY-TR-C5-ceramide	Molecular Probes (ThermoFisher)	D7540	fluorescent lipid
BODIPY- FLC5-hexadecanoyl phosphatidylcholine (HPC*)	Molecular Probes (ThermoFisher)		fluorescent lipid for protein density calibration
egg L-α-phosphatidylcholine (eggPC)	Avanti	840051	used for calibrating the tube radius constant
β-casein from bovine milk (>99%)	Sigma Aldrich	C6905	used for passivating the micropipette and the experimental chamber
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903
D(+) glucose	Sigma Aldrich	G7021
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
Tris	Sigma Aldrich	10708976001
osmometer	Loser	n/a
Pt-wires, 0.5 mm diameter, 99.99% pure	Goodfellow USA	PT005139	used for GUV electroformation
function generator		n/a	used to create current for GUV electroformation
putty sealant	Vitrex (from CML France)	CRIT 140013	used to seal the electroformation chamber
bath sonicator		n/a	useful to clean the electroformation chamber, but not crucial
Nikon TE2000 inverted microscope, eC1 confocal system (Nikon), with two laser lines (λ = 488 nm and 543 nm); optical tweezers induced by a 5 W ytterbium fiber continuous wave laser (λ > 1070 nm; IPG GmBH Germany)			an example of a confocal microscopy system equipped with optical tweezers
micromanipulators		n/a
borosilicate capillaries (with internal and external radii of 0.78 mm and 1 mm, respectively)	Harvard apparatus	30-0036
micropipette puller	Sutter Instrument	P-2100
microforge	Narishige	MF-800
piezoelectric actuator	Physik Instrumente	n/a
polystyrene streptavidin coated beads (diameter 3.2 µm)	Spherotech	SVP-30-5