I κB quinase 1/α (IKK1/α CHUK) é uma Ser/Thr proteína quinase que está envolvida em uma miríade de atividades celulares, principalmente através da ativação de fatores de transcrição NF-κB. Aqui, descrevemos as principais etapas necessárias para a produção e a determinação de estrutura de cristal desta proteína.
Uma classe de estímulos extracelulares requer ativação de IKK1/α para induzir a geração de uma subunidade de NF-κB, p52, através do processamento de seu precursor p100. P52 funciona como um homodímero ou heterodímero com outra subunidade de NF-κB, RelB. Esses dímeros regulam, por sua vez, a expressão de centenas de genes envolvidos na inflamação, sobrevivência da pilha e ciclo celular. IKK1/α permanece principalmente associado com IKK2/β e NEMO como um complexo ternário. No entanto, uma pequena piscina de também é observada como um complex(es) de baixo peso molecular. Desconhece-se a actividade de transformação de p100 é desencadeada por ativação de IKK1/α dentro a maior ou a menor piscina complexa. Atividade constitutiva de IKK1/α foi detectada em vários tipos de câncer e doenças inflamatórias. Para entender o mecanismo de ativação de IKK1/α e permitir a sua utilização como um alvo de drogas, manifestámos IKK1/α recombinante em sistemas de host diferentes, tais como Escherichia coli, inseto e células de mamíferos. Conseguimos expressar IKK1/α solúvel em baculovirus infectados células de inseto, obtenção de quantidades de mg de proteína altamente pura, cristaliza na presença de inibidores e determinar sua estrutura de cristal de raio-x. Aqui, descrevemos as etapas detalhadas para produzir a proteína recombinante, sua cristalização e sua determinação de estrutura de cristal de raio-x.
Atividades transcriptional da família NF-κB de factores de transcrição dimérica são necessárias para diversas funções celulares, variando de inflamação e imunidade a sobrevivência e a morte. Estas actividades são rigorosamente controladas em células e uma perda de regulamento conduz a diversas condições patológicas, incluindo doenças auto-imunes e câncer1,2,3. Na ausência de um estímulo, as atividades do NF-κB são mantidas inibidas pelo i-κB (inibidor da – κB) proteínas4. A fosforilação de resíduos específicos de EMISSAO SERIE sobre proteínas i κB marca-los para ubiquitination e degradação proteasomal subsequentes ou processamento seletivo5. As duas cinases Ser/Thr altamente homólogas, IKK2/β e IKK1/α, atuam como centrais reguladores das actividades do NF-κB realizando esses eventos de fosforilação6,7.
Interações entre um ligante e um receptor transduces um sinal através de uma série de mediadores, levando à ativação de fatores de NF-κB. O processo de sinalização do NF-κB pode ser classificado em duas vias distintas – canônica e não-canônicos (alternativo)8. A atividade de IKK2/β regula principalmente o NF-κB sinalização do percurso canônico que é essencial para inflamatória e inata respostas imunes9. Uma característica distinta deste percurso é uma ativação rápida e de curta duração de IKK2/β10 dentro de um complexo de IKK até então bioquimicamente descaracterizada — presume-se que seja composto de IKK1 e IKK2, bem como um componente regulamentar, NEMO (NF-κB modulador essencial )11,12,13. Entre as duas subunidades IKK catalíticas do complexo IKK, IKK2 é principalmente responsável14 para a fosforilação de resíduos específicos de protótipos IκBs (α – β e γ-) vinculado a NF-κB e também uma proteína i κB atípica, NF-κB1/p105, que é um precursor do NF-κB p50 subunidade5. Fosforilação induzido ubiquitination e degradação proteasomal de i κB (ou processamento de p105) leva à liberação e ativação de um conjunto específico de NF-κB dímeros15. Aberrante atividade do NF-κB devido a função mis regulamentada de IKK2 tem sido observada em muitos cânceres, bem como em doenças auto-imunes2,3,16.
Em contraste com IKK2/β, a atividade de IKK1/α regula NF-κB sinalização da via não-canônicos, que é essencial para o desenvolvimento e a imunidade. IKK1 fosforila resíduos específicos da NF-κB2/p100 em seu segmento IκBδ C-terminal, que leva ao seu processamento e geração de p52. A formação de p52:RelB transcricionalmente ativo heterodímero inicia uma resposta lenta e sustentada para sinais do desenvolvimento7,17,18,19,20. Curiosamente, a geração da central NF-κB fator p52 este percurso é criticamente dependente de outro fator,21,NF-κB induzindo quinase (NIK)22, mas não no IKK2 ou NEMO. Nas células de descanso, o nível de NIK permanece baixo devido a sua constante degradação proteossomo dependente23,24,25. Após estimulação das células por ligantes ‘não-canônicos’ e em certas células malignas, NIK torna-se estabilizada para recrutar e ativar IKK1 / α. atividades da quinase de NIK e IKK1 são essenciais para o processamento eficiente de p100 em p527. IKK1 e NIK fosforilar três serinas (Ser866, 870 e 872) da NF-κB2/p100 em seu segmento IκBδ C-terminal, levando para seu processamento e geração de p52. Aberrante ativação da via não-canônicos tem sido implicada em muitas Neoplasias, incluindo mieloma múltiplo de27,26,28.
Vários inibidores altamente eficientes e específicos para IKK2/β são conhecidos, embora nenhum até agora têm acabou por ser uma droga eficaz. Em contraste, os inibidores específicos/α-IKK1 são escassos. Isto pode se originar em parte de nossa falta de informações estruturais e bioquímicas na IKK1/α, que limita a nossa compreensão da base mecanicista da ativação do NF-κB pelo IKK1 em células e desenho racional de droga. As estruturas de raio-x de IKK2/β nos forneceram insights sobre o mecanismo de ativação de IKK2/β29; no entanto, essas estruturas não poderiam revelar como diferentes estímulos montante desencadear a ativação de IKK1/α ou β/IKK2 para regular a conjuntos distintos de NF-κB atividades 30,31. Para entender a base mecanicista subjacente a distinta função sinalização de IKK1/α e estabelecer uma plataforma para o projeto racional da droga, focamos na determinação da estrutura de IKK1/α.
Solução de produção, cristalização e estrutura de duas proteínas IKK relacionadas
Partimos para determinar a estrutura de cristal de raio-x de IKK1/α com a noção de que seria um exercício relativamente simples, dado a nossa experiência com a produção de proteína IKK2/β, cristalização e a determinação de estrutura. No entanto, nos surpreendemos altamente que essas duas proteínas relacionadas comportou-se muito diferentemente em relação a facilidade de cristalização. Apesar dos …
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos os funcionários a 19ID de Luz Síncroton, 24ID e 13ID no Advanced Photon Source, Lemont, IL, pelo apoio durante a coleta de dados em vários cristais. Nós estamos gratos ao Dmitry Lyumkis, Instituto Salk para buscar-no mapa de cryo-EM baixa resolução em estágios iniciais EM mapa/modelo de edifício, que foi usado para construir o modelo de pesquisa de substituição molecular inicial do IKK1. A pesquisa que conduz a estes resultados recebeu financiamento de bolsas NIH AI064326, CA141722 e GM071862 para GG. SP é atualmente um Wellcome Trust DBT Índia intermediário companheiro.
Cellfectin/Cellfectin II | Thermo Fisher Scientific | 10362100 | Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II |
Sf900 III Insect cell medium | Thermo Fisher Scientific | 12658-027 | |
SF9 cells | Thermo Fisher Scientific | 12659017 | |
anti-IKK1 antibody | Novus Biologicals | NB100-56704 | Previously sold by Imgenex |
anti-PentaHis antibody | Qiagen | 34460 | |
PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Nitrocellulose can also be used |
Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
Bradford assay reagent | BioRad | 500001 | |
Superdex 200 column | GE Healthcare | 28989335 | |
Amicon concentrator | Millipore | UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024 | |
Compound A | Bayer | ||
Calbiochem IKK-inhibitor XII | Calbiochem | 401491 | |
Staurosporine | SIGMA | S4400 | |
MLN120B | Millenium | Gift item | |
AMPPNP | SIGMA | A2647 | |
Dextran sulfate | SIGMA | 51227, 42867, 31404, | |
Dextran sulfate | Alfa Aesar | J62101 | |
PEG | SIGMA | 93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172 | Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #. |
Crystallization Screens | |||
Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT) | Hampton Research | HR2-130 | |
Index HT | Hampton Research | HR2-134 | |
PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT) | Hampton Research | HR2-139 | |
PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT) | Hampton Research | HR2-086 | |
SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT) | Hampton Research | HR2-136 | |
Crystal mounts | Hampton Research | HR8-188, 190, 192, 194 | |
Synchrotron | The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory | Beamline 19 ID | The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines. |