Bu iletişim kuralı hemipteran böcekler, yaprak bitleri gibi besleme tarafından üretilen bitkilerde kalsiyum sinyalleri analiz etmek için basit bir yöntem özetliyor. GFP kalsiyum Biyoalgılayıcı GCaMP3 ile dönüştürülmüş Arabidopsis thaliana kalsiyum dinamiği yüksek zamansal ve mekansal çözünürlüğü ile gerçek zamanlı vivo içinde görüntüleme için izin verir.
Kalsiyum iyonları bitki savunma yanıt mikrobiyal elicitors ve böcekler, sistemik kalsiyum almak yanında çiklet neden yaralama için kurulan bir parçasını oluşturan kalsiyum sinyal ile biyotik etkileşimleri sırasında anahtar sinyal varlıklar olduğu tahmin edilmektedir bitkilerde sinyalleri. Ancak, kalsiyum vivo içinde biyotik stres sırasında rolü hala belli değildir. Bu iletişim kuralı tarafından hemipteran baş belası besleme sırasında bitkilerde kalsiyum sinyalleri tespit etmek için bir genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensör kullanımını açıklar. Hemipterans yaprak bitleri gibi küçük bir sayı içeren hücrelerin uzmanlaşmış, ağız, bir bitki yaralama yanıtından farklı bir biyotik stres ile karşılaşınca kalsiyum dynamics eğitim için ideal bir araçtır geliştirmelerde emme uzamış pierce. Buna ek olarak, floresan biyosensörler sinyal molekülleri in vivo hayvan ve bitkiler ölçüm devrim. Bitki kalsiyum dynamics gerçek zamanlı görüntüleme sırasında yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlük ile besleme böcek için model bitki Arabidopsis thaliana GCaMP3, GFP tabanlı kalsiyum Biyoalgılayıcı ifade sağlar. Bir tekrarlanabilir ve sağlam tahlil öncesinde, sırasında ve sonra böcek besleme sitozolik kalsiyum dynamics sürekli ölçüm için izin müstakil GCaMP3 yaprakların Floresans mikroskobu ile geliştirilmiş. Bu bir hızlı kalsiyum son derece lokalize ayrıcalık birkaç dakika içinde oluşan site besleme yaprak biti çevresinde ortaya koymaktadır. Arabidopsis thaliana mutantlar hızlı oluşturulmasında olgusunun moleküler analiz kolaylaştırmak için kullanılmasına iken Protokolü gibi ek böcek türleri, diğer biyotik streslere için adapte edilebilir.
Kalsiyum (Ca2 +) tesislerinde en her yerde sinyal unsurlardan biridir. Sitozolik Ca2 + konsantrasyonu geçici bir artış ([Ca2 +]cyt) akış yönündeki bileşenlere karmaşık ağ tarafından deşifre ve her iki abiyotik ve biyotik streslere1,2yanıt olarak ilgilenmektedir. [Ca2 +]cyt artış ilk yanıt için bitki savunma yanıt3,4,5ortak bir parçasını oluşturan mikrobiyal elicitors biridir. [Ca2 +]cyt yükselir ayrıca karşılık yaralama yanında çiklet böcekler, lepidopterans6,7gibi neden gözlenmiştir. Ancak, potansiyel rolü yalnızca birkaç hücreleri zarar biyotik tehditler yaşamak için2 + sinyalleri yanıt değil keşfedilmeyi Ca bitki. Yeşil şeftali yaprak biti Myzus persicae dünya tarım8,9, önemli bir tehdit temsil eden bir hemipteran böcek ve sızma2 + hücre dışı uzaydan içinde gözlenen Ca bırakır M. persicae10ile istila. Yaprakları bir floresan Ca2 + Biyoalgılayıcı, yaprak bitleri ve hangi ile GCaMP3 sunan yeni araçları kullanarak üzerinden M. persicae yemek yerken bitki Ca2 + ölçmek için sağlam ve yinelenebilir bir yöntem sinyalleri bu protokolü özetliyor Ca2 + rolü biyotik etkileşimleri sırasında incelemek.
CA2 +-seçici microelectrodes eski [Ca2 +] bitkiler11,12‘ ölçmek için kullanılmıştır. Daha yakın zamanlarda, Kollarındaki ve floresan yaklaşımları standart haline. Bu biyosensörler Ca2 + bağlamak ve ışık yayarlar un paralellik fırsatları Ca2 + dynamics hücreleri ve tüm dokularda çalışma izin. CA2 + biyosensörler boyalar enjekte veya stabil dönüştürme (genetik olarak kodlanmışYani, biyosensörler) yoluyla organizmanın genom dizisi kodlama Biyoalgılayıcı giriş üzerine üretilen. İkinci kolayca canlı doku olarak gösterilen ve hücre altı Yerelleştirme13yeteneğine sahip olmanın büyük avantajlar sunuyor. Aequorea victoria (denizanası) izole aequorin protein bitkiler14‘ te dağıtılan ilk genetik olarak kodlanmış Ca2 + Biyoalgılayıcı olduğunu. Kollarındaki bir protein aequorin ağartma chromophore ve autofluorescence15önler dış ışık tarafından uyarma gerektirmez. Aequorin başarıyla Cerayanlar [Ca2 +] sıcaklık16, patojenler17,18,19da dahil olmak üzere çeşitli uyaranlara yanıt ölçmek için kullanılan, tuz stres20 ,21ve yaralama7. Ancak, tek tek hücreleri ve zavallı sensör ifade zor13kurcalayarak [Ca2 +] Cerayanlar tespiti yapmak nispeten düşük sinyal şiddeti tarafından dezavantajlı.
Bu belli Ca2 + biyosensörler gelişimi detaylı hücre altı ve doku düzeyinde analiz Ca2 + dynamics için izin vererek aequorin tamamlanmaktadır. Floresans rezonans enerji transferi (FRET) are bir-in en yaygın floresan biyosensörler-Cameleons dayalı. PERDE Cameleons iki protein, genellikle CFP ve YFP, Ca2 + CFP-YFP bağlayıcı bölge, calmodulin etki alanına bağlama tarafından indüklenen konformasyonal değişim tarafından yakın temas getiren oluşur. Bu kişinin enerji aktarımı CFP YFP için ve bu fluorophores floresan elde edilen değişikliği için [Ca2 +] miktar doğru iki floresan sinyallerini oranının hesaplanması ile sağlar fluorophores22. Onlar daha az protein23 ifade düzeyi tarafından etkilenen ve sık sık büyük bir floresan verim var gibi hücresel ve hücre altı görüntüleme23için izin aequorin ve sigara ratiometric floresan boyalar için üstün perde Cameleons. Örneğin, FRET Cameleons son zamanlarda uzun mesafe Ca2 + sinyalleri tesislerinde tanımlamak ve bunlar hücresel düzeyde24,25,26gidermek için kullanılmıştır.
Son bir atılım floresan GFP tabanlı Ca2 + biyosensörler ile son derece hassas tek-fluorophore (tek-FP) biyosensörler gelişme olmuştur. Tek-FP biyosensörler oluşur tek bir dairesel yayın sıralanmış GFP bağlı bir calmodulin ve M13 peptid, calmodulin için bağlama, yani bir su-aracılı tepki GFP arasındaki calmodulin sonuçlanan Ca2 + ile protonate GFP ve artış Floresan verim27,28,29. Tek-FP sensörler perde Cameleons, basit deneysel tasarım ve potansiyel olarak daha yüksek bir zamansal çözünürlük30görüntüleme dahil olmak üzere çeşitli avantajlar sunuyor. Her ne kadar tek-FP sensörler mutlak [Ca2 +] basit ölçmek olamaz zamansal ve mekansal dinamiklerini Ca2 + analizi5,23sinyalleri için FRET sensörler üstün olduklarını. GCaMPs bir best-established tek-FP sensörler28 ve kendi floresan verim, dinamik alan, Ca2 + benzeşme ve sinyal noise oranları31,32 artırmak için çeşitli revizyonlar uğramıştır , 33 , 34. GCaMPs başarıyla kullanıldığını hayvan sistemleri, Zebra balığı motor nöronlar35 ve meyve nöromüsküler kavşak34sinek gibi. GCaMP3 rasgele mutagenesis tek-FP sensörler, vericiyi GCaMP636 ve GECOs29dahil olmak üzere ek sınıflarda sonuçlandı. GECOs son zamanlarda Arabidopsis thaliana (bundan böyle Arabidopsis da adlandırılır) Ca2 + Cerayanlar ATP, kitin ve bakteriyel elicitor flg22 karşısında ölçmek için kullanılmaya başlanmıştır. Bu çalışmada de R-GECO Biyoalgılayıcı perde Cameleon YC3.6 maksimal sinyal değişikliği ve sinyal-gürültü oranı5açısından geride gösterdi.
Kullanım kolaylığı, yüksek floresan verim ve GCaMP biyosensörler ile elde edilebilir yüksek zamansal çözünürlük nedeniyle, GCaMP3 altında karnabahar mozaik virüsü 35S organizatörü Arabidopsis içinde genetik olarak kodlanmıştır. GCaMP3 tarafından ölçülen Ca2 + sinyalleri detaylı moleküler analizi için genetik araçları Arabidopsis araştırma için kullanılabilir sağlar. Buna ek olarak, GCaMP3 Biyoalgılayıcı bir costlier confocal sistemi yerine bir floresan mikroskop altında görüntülenmeyecektir. Bu iletişim kuralı bütün doku Imaging, ne zaman canlı biyotik streslere ile deneyler temel sağlar. Öyle ki su, böcek kaçış önlemek için ve belirli bir dokusu ile besleme kısıtlamak için müstakil 35S::GCaMP3 bitki yapraklarından satışa çıkardı deney tasarlanmıştır. Bu makalede açıklanan yöntemi bu nedenle M. persicae tarafından besleme sırasında yaprak Ca2 + dinamikleri analiz için sağlar, yanıt sinyali bir roman bitki karakterizasyonu kaynaklanan. Bu yöntem aynı zamanda ek böcek türleri ve mikrobiyal patojenler, gibi diğer biyotik streslere ve kökleri gibi diğer bitki doku ile çalışmaya adapte edilebilir.
Bu makalede açıklanan yöntemi bitki gerçek zamanlı analiz için böcek besleme gibi biyotik stres sırasında sinyal Ca2 + sağlar. Bu tür tehditlerin ilk bitki yanıtlarını bir yerelleştirilmiş [Ca2 +]cyt yükselmesine beslenme çevresinde böcek biri olduğunu gösterir. Mutantlar kullanımı ile bu yöntem sağlayacak böyle sinyallerin moleküler ve fizyolojik karakterizasyonu daha önce mümkün değildi. Bu iletişim kuralı kritik bir adımda müstakil yaprakları (Adım 3.2) ayırma işlemi sırasında veya böcekler yaprakları (Adım 4.5) aktarırken aşırı rahatsız olmadığını sağlamaktır. Geçerli protokol bir mutlak konsantrasyon yerine [Ca2 +]cyt göreli bir ölçü sağlar verilen bu mikroskop ayarları deney boyunca sabit tutulur hayati önem taşımaktadır. Ayrıca insan önyargı için potansiyel ROIs yelpazesi ve veri analizi sırasında ve bu nedenle, bu deneyler çift-kör yapılmaktadır önerilir.
Bu iletişim kuralı ile biyotik stres sırasında [Ca2 +]cyt ölçme çok önemli avantajı vardır. Birincisi, tek bir fluorophore ile yüksek bir floresan verimli kullanımı confocal mikroskop kullanarak daha az pahalı olduğu bir stereomicroscope üzerinde yapılacak görüntüleme sağlar. Kaydetmek için bir ölçüm olarak tek bir fluorophore da veri toplama ve analiz basit, kullanır. Buna ek olarak, bir stereomicroscope kullanımına bitki yaprak biti etkileşimler de dahil olmak üzere birçok biyotik etkileşimler meydana büyük bir kayma ölçekte verilen bu gerekli olan tüm yaprakları, görüntüleme için izin verir. Görüntü yüksek zamansal çözünürlük GCaMP3, bağlama23,30 ve yüksek floresan verim sonra Ca2 + algılayıcı disassociation hızlı temel ile mümkün yakalama, ilâ alınması ölçülerini sağlar Her 5 s. Ayrıca, yaprak tahlil böcek, Bütün bitkiler (hazırlık aşamasında)üzerinde bu tür deneyler için adım sınırlayan bir anahtar kaçış engeller. Müstakil yaprakları da böcek önce sırasında ve sonrasında beslenme Ca2 + dinamikleri analiz için izin önceden tanımlanmış bir konumdan beslemeleri emin olun. Bu iletişim kuralı da benzer gelişim aşamalarında yaprakları analiz için kullanılmasını sağlar.
Ana dezavantajı ise bu protokol bir sigara ratiometric Biyoalgılayıcı kullanımından kaynaklanır. İle tek-FP biyosensörler, GFP emisyon varyasyon [Ca2 +]cyt, hücresel pH, hareket veya Biyoalgılayıcı ifade düzeyinde değişiklikler gibi dışında deneysel değişkenleri neden olabilir. YFP CFP enerji aktarımı yalnızca Ca2 + bağlama üzerine gerçekleştiği sırada bu sorunları perde Cameleons ile perde sırasında karşılaşılan değil. Bireysel fluorophores floresan özelliklerini değiştirmek diğer koşullara karşı değişiklikleri CFP yoğunluğunu YFP taklit vermemektedirler ve bunların çoğu ölçülerini doğal olarak kullanılır ratiometric hesaplama normalleştirir diğer optik eserler23,30. Bu mutlak [Ca2 +]cyt tahminler FRET Cameleons ile daha güvenilir kılar. Algılamak ve bitkiler5,(in preparation)biyolojik olayları ayırdetmek hala yeterli olsa da sonuç olarak, GCaMP3 en iyi bir Biyoalgılayıcı göreli [Ca2 +]cyt, ölçmek için kullanılır. Bu nedenle, gözlenen etkisi Ca2 +Ca dahil2 +nedeniyle, olduğunu göstermek için denetimleri kullanmak esastır-genetik mutantlar(hazırlık aşamasında) veya farmakolojik Ca2 + kanal inhibitörleri La3 + gibi ilişkili . Önemlisi, tek-FP biyosensörler genellikle büyük floresan verim ve daha fazla dinamik alan (Yani, Variety Ca2 + bağlama üzerine bir artış) perde Cameleons23GCaMP için daha uygun hale getirir, daha görüntüler doku düzeyinde görüntüleme, perde Cameleons bir confocal mikroskop5,25ile hücresel görüntüleme için yararlı bir araç iken.
Bu iletişim kuralı çalıştırılırken, bazı konularda sorun giderme gerektiren ortaya çıkacak mümkündür. Örneğin, bu büyük [Ca2 +]cyt yükselmeler vardır (tedavi edilmezse) denetim yaprak görüntüler (adım 6.3) atılma örnekleri önerilir. Böyle geçişler olasılıkla mikroskobu tarafından indüklenen stres sonucu oluşur. Gerçekten de, mavi ışık bilinen Ca temin için sinyalleri2 + 38,39,40,41ve yoğun ışık da sıcaklık ve ozmotik vurguluyor, neden olabilir her ikisi de Ayrıca [Ca2 +]cyt yükselmeler21,25,42temin. Sonuç olarak, böyle stres azaltmak için iyi havalandırılmış ve ısı kontrollü bir odada deney yapmak için ve gereksiz yere uzun pozlama süreleri önlemek için önemlidir. Yaprakları aşırı dekolmanı veya dokunmatik elde edildi [Ca2 +]cyt yükselmeler43,44,45önlemek için mikroskobu sırasında değil bozmaya önemlidir. Sorunlarla da böcek yerleşme ile karşılaşılabilir. M. persicaeile böcekler birkaç örnekte yapraklarda razı değil. Bu yara elde edildi savunmasında müstakil yaprakları46,47ya da böcekler tarafından mavi ışık rahatsızlık sonucu olabilir. Nitekim, M. persicae imgelemde 490 nm48bir en yüksek hassasiyetle da dahil olmak üzere üç photoreceptors tarafından yönetilir. Mikroskopi maruz kalma azaltmak ve yaprak biti itina ile işleme sıkıntı azaltmak ve yerleşme teşvik olabilir.
Geçerli kağıt özetlenen Protokolü bitki böcek etkileşimleri moleküler anlayışı ve biyotik stres bitki yanıt üzerine yeni anlayışlar verir. Bu böcek besleme için ilk bitki yanıtlardan birini görselleştirme sağlar ve araştırmalar önemli Arabidopsis genetik kaynakları kullanılabilir kullanımı ile daha da kolaylaştırır. Ayrıca, bu iletişim kuralı için canlı organizmalar, kullanımına izin verir olarak49 veya elicitors50ayıklar. Gelecekte, bu teknik ek böcek türleri, nematodlar veya mikrobiyal patojenler, gibi diğer biyotik streslere yanı sıra abiyotik stres uygulanabilir. GCaMP3 mikroskobu diğer bitki doku, yaprak veya hatta bütün bitkiler alternatif ROIs görüntü için de değiştirilebilir. Ayrıca, genetik olarak Biyoalgılayıcı için potansiyel olduğunuly ek bitki türü kodlanmış. Sonuç olarak, bu yazıda belirtilen iletişim kuralı moleküler temeli bitki ve diğer türler arasında roman biyotik etkileşimlerin bir aralıktaki sinyal Ca2 + gizli potansiyeline sahiptir.
The authors have nothing to disclose.
Mikroskobu ile ilgili tavsiyeler için Grant Calder (John Innes Centre, U.K.) teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar ayrıca John Innes Merkezi Bahçe ve Entomoloji bölümler onların yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser bir doktora öğrencilik gelen John Innes Vakfı (TV), tarafından desteklenen hibe B/JJ004561/1 BBSRC ve John Innes Vakfı (TV, M.A., J.C., S.M., S.H., m. ve D.S.), bir yıl içinde sanayi yerleşim John Innes Merkezi (M.A.) , İngiltere’de (JC), JST PRESTO (M.T.) ve hibe MCB 1329723 ve IOS-1557899 Ulusal Bilim Vakfı (M.T. ve S.G.) biyokimyasal toplumdan bir yaz öğrencilik.
35S::GCaMP3 Arabidopsis | John Innes Centre/Universty of Wisconsin | – | Step 1.1 |
100 mm2 square plastic plates | R & L Slaughter Ltd, Upminster, UK | For growing GCaMP plants (Step 1.1) | |
¼ strength Murashige and Skoog (MS) medium | homemade: 1.1 g Murashige and Skoog medium, 7.5 g sucrose, 10 g Formedium agar, 1 L de-ionised water | – | For growing GCaMP plants (Step 1.1) |
Col-0 Arabidopsis | – | – | For growing aged aphid colony (Step 2.1) |
Myzus persicae(Sulzer) | clone US1L, Mark Stevens, Brooms Barn | – | Orginally from Rothamsted Research, UK (Step 2.1) |
Artist's paintbrush size 2 | Hobbycraft | 610101 | To tranfer aphids (Steps 2.1, 2.4 and 4.6) |
96-well MicrotitreTM plate | ThermoFisher Scientific | 2101 | To contain the detached GCaMP3 leaves (Step 3.2) |
Aluminium foil | Wrap Film Systems, Telford, UK | 26B06 | To cover plates with floating leaves overnight (Step 3.3) |
Clear plastic wrap | SC Johnson & Son, Racine, WI, USA | To cover plates with floating leaves overnight, and to cover leaves during microscopy (Steps 3.3 and 4.7) | |
M205FA stereo microscope | Leica Microsystems | – | For GFP imaging (Step 4.1) |
Leica Application Suite v3.2.0 | Leica Microsystems | Microscope software (Step 4.1) | |
Fiji (Image J) v1.48a | National Institutes of Health, USA) | – | For image analysis (Step 6.1) |