Синтез инфекционных бактериофагов в E. coli-на основе свободных клеток выражение системы
Summary
Новое поколение свободных клеток транскрипции перевод платформ был инженерии построить биохимических систем в vitro через исполнение цепи гена. В этой статье мы опишем, как бактериофагов, таких как MS2, ΦΧ174 и Т7, синтезируются из их геном, с использованием всех в свободных клеток E. coli TXTL системы.
Abstract
Новое поколение систем свободных клеток транскрипции перевод (TXTL), для большей гибкости и модульности, предоставляют новые возможности для выполнения базовых и прикладных наук в пробирке реакция. За последнее десятилетие свободных клеток TXTL стала мощным инструментом для широкого круга новых междисциплинарных исследований районах связанные с количественным и синтетических биологии. Новые платформы TXTL особенно полезны для строительства и допросить биохимических систем через выполнение синтетических или природных гена цепей. В пробирке TXTL оказалось удобно быстро прототип регуляторных элементов и биологических сетей также относительно пилки молекулярной самосборки нашли механизмов в живых системах. В этой статье мы расскажем как инфекционные бактериофагов, например мс2 (РНК), ΦΧ174 (ssDNA) и Т7 (dsDNA), полностью синтезируются из их геном в реакциях одно горшок с помощью всех Escherichia coli, свободных клеток TXTL системы. Синтез трех Коли количественно с помощью assay металлической пластинкы. Мы покажем, как доходность синтезированных Фаговые зависит от биохимических параметров реакций. Молекулярные скученности, подражания через контролируемые концентрации PEG 8000, влияет на количество синтезированных бактериофаги приказами величин. Мы также описывают, как усилить бактериофаги и очистить их геномов. Набор протоколов и результаты, представленные в этой работе должна представлять интерес для многодисциплинарного исследователей, участвующих в свободной ячейке синтетической биологии и биотехнологии.
Introduction
За последнее десятилетие адрес Роман приложениям в эмерджентных междисциплинарных исследований областей, связанных с синтетическими и количественных биологии была разработана технология ячейки свободного выражения. Первоначально используется для выражения независимо от живого организма белки, новые клетки-TXTL систем были разработаны для оба фундаментальных и прикладных наук1,2, значительно расширение сферы применения этой технологии. Новое поколение TXTL платформ была разработана чтобы быть удобным для пользователя, более эффективным (достигнув 2 мг/мл синтеза белка в пакетный режим3), более универсальным на уровне транскрипции4и модульные тем чтобы легко интегрировать Роман природных или синтетических функций, которые расширяют возможности существующих биологических систем5,6. В частности свободных клеток TXTL системы стали удобно для быстрого прототипирования генетических программ, таких как регуляторных элементов или небольших генетической цепи7,8,9, уменьшая дизайн строить тест цикла на несколько дней. Удивительно, новый TXTL системы способны также обработки больших программ ДНК, таких как полный синтез Коли10,11, демонстрируя сильный достаточно выступления в поддержку воссоздания активных геномной ДНК закодированы живых существ.
TXTL систем представляют многие технические преимущества, по сравнению с традиционными в vitro конструктивного биохимических анализов. Бесплатный сотовый TXTL связывает процесс экспрессии генов конечного продукта в ограниченной и открытой среды, в отличие от сложных цитоплазме живой клетки. TXTL использует ДНК для воссоздания биохимических систем в пробирке, который, с современными методами Ассамблеи ДНК, является доступным и быстрым в дополнение к не требующие требовательных белка очистки шагов. Клетки свободной выражение обеспечивает прямой доступ к большинству компонентов в биохимических реакциях, таким образом позволяя глубже рассечение молекулярных взаимодействий12. В TXTL реакции можно изменить биохимические и биофизические параметры по желанию, который почти невозможно в живой клетке. Учитывая эти преимущества и недавние улучшения, TXTL технология становится все более и более популярным как альтернативную платформу для синтетических и количественных биологии. В то время как научно-исследовательское сообщество, с помощью TXTL стремительно растет и TXTL становится стандартной технологии в биоинженерии, важно, чтобы понять, как использовать такие платформы, с тем чтобы разработать адекватные практики, связанные с исполнением TXTL реакций и к Интерпретация результатов.
В этой статье, мы опишем, как использовать все системы TXTL E. coli синтезировать в один горшок реакциях, бактериофаги от их геном11, таких как MS2 (РНК, 3.4 kb), ΦΧ174 (ssDNA, 5.4 kb) и Т7 (dsDNA, 40 КБ). Мы покажем, как количество бактериофаги синтезированных изменения в отношении некоторых биохимических параметров реакций (концентрации магния и калия). Молекулярные скученности, подражания через диапазон PEG 8000 концентрации, имеет огромное влияние на синтез Фаговые на несколько порядков. Реализация таких больших биохимических систем в одной пробирке реакциях, которые одновременно пилки процессы транскрипции, перевод и самостоятельной сборки, это интересно для решения основных вопросов, связанных с биологии и биофизики 10 (ген регулирование, самостоятельной сборки), а также для разработки приложений, таких как повторное использование фага функций для построения новых наноструктур13. Помимо практических на TXTL мы предоставляем методы для Фаговые амплификации, геном добычи и очистки и ФАГ количественной оценки в assay металлической пластинкы. Методы, представленные в этой рукописи являются подходящими для исследователей, которые используют E. coli экстракт на основе клеток-систем и заинтересованы в бактериофагов.
Протоколов, представленных в этой работе можно резюмировать следующим: 1) фага амплификации (1 день: подготовить прививка клетки, день 2: Одноместный зубного налета, несколько Фаговые роста, концентрации и день 3: Очистка ФАГ), 2) Double-stranded экстракции ДНК генома (извлечение фенола/хлороформ) и 3) свободных клеток Фаговые реакции и титр эксперимента (1 день: плиты клетки хозяина и сделать плиты агара, день 2: реакции свободных клеток и принимающей ячейки до культуры и день 3: принимающей ячейки культуры и ФАГ титр).
Protocol
Representative Results
Discussion
После технику в Чэнь, и др. 14 для ГФПК, критически важный шаг достигается при определении надлежащих условий для суперинфекции. Параметр, который наиболее близко контролирует штамм хост способность выдерживать суперинфекции часто является начальной концентрации зар?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот материал основан на работе, поддерживаемых управлением военно-морских исследований премии номер N00014-13-1-0074 (в.н.), человека пограничной науки программы предоставить номер RGP0037/2015 (в.н.), и двусторонний научный фонд предоставить 2014400 (в.н.).
Materials
| Ultracentrifugation tubes | Beckman Coulter | 344057 | |
| Conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Gradient maker | BioComp Gradient Master | see Anal Biochem. 1985 Jul;148(1):254-9. | |
| Syringe and Blunt Cannula | Monoject | 8881513918 and 888202017 | |
| Wide-bore pipette tips | Fischerbrand | 02-707-134 | |
| Plaque counter | New Brunswik Scientific | Colony Counter Model C-110 | |
| Culture tubes | Fischerbrand | 14-961-33 | |
| Cell-free system | Mycroarray Inc | Mytxtl | |
| BioComp Gradient Master | BioComp Instruments | Model 105ME | |
| LB agar plate recipe | 25 g/L Luria-Bertani medium (LB Broth, Miller – Fisher BioReagents product number BP1426) and 15 g/L Bacto-Agar solid (Brenton, Dickenson and Company – product number 214010). |
References
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnol Adv. , (2011).
- Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell. Metab Eng. , (2011).
- Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/mL of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
- Shin, J., Noireaux, V. An E. coli cell-free expression toolbox: application to synthetic gene circuits and artificial cells. ACS Synth Biol. 1 (1), 29-41 (2012).
- Chemla, Y., Ozer, E., Schlesinger, O., Noireaux, V., Alfonta, L. Genetically expanded cell-free protein synthesis using endogenous pyrrolysyl orthogonal translation system. Biotechnol Bioeng. , (2015).
- Hong, S. H., Kwon, Y. C., Jewett, M. C. Non-standard amino acid incorporation into proteins using Escherichia coli cell-free protein synthesis. Frontiers in Chemistry. 2, (2014).
- Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12672-12677 (2003).
- Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for Rapid Prototyping of Synthetic Biological Circuits in an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free System. Acs Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).
- Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. , (2015).
- Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction. ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).
- Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth Biol. , (2016).
- Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. Coarse-grained dynamics of protein synthesis in a cell-free system. Phys Rev Lett. 106 (4), 048104 (2011).
- Daube, S. S., Arad, T., Bar-Ziv, R. Cell-free co-synthesis of protein nanoassemblies: tubes, rings, and doughnuts. Nano Lett. 7 (3), 638-641 (2007).
- Chen, X., et al. An immunoblot assay reveals that bacteriophage T4 thymidylate synthase and dihydrofolate reductase are not virion proteins. J Virol. 69 (4), 2119-2125 (1995).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. J Vis Exp. (79), e50762 (2013).
- Shin, J. N. V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. J Biol Eng. , (2010).
- Caschera, F., Noireaux, V. Preparation of amino acid mixtures for cell-free expression systems. Biotechniques. 58 (1), 40-43 (2015).
- Minton, A. P. How can biochemical reactions within cells differ from those in test tubes. J Cell Sci. 119, 2863-2869 (2006).
- Minton, A. P. Implications of macromolecular crowding for protein assembly. Curr Opin Struct Biol. 10 (1), 34-39 (2000).
- Zimmerman, S. B., Minton, A. P. Macromolecular crowding: biochemical, biophysical, and physiological consequences. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 22, 27-65 (1993).
