ويحدد هذا البروتوكول سير العمل للجين كريسبر/Cas9-على أساس تحرير النظام للإصلاح من الطفرات في خلايا الثدييات. هنا، علينا استخدام نهج اندماجي لتحرير الجينات مع استراتيجية تجريبية متابعة مفصلة لقياس تشكيل إينديل في الموقع المستهدف، في جوهرها، تحليل الطفرات في الموقع.
تحرير الجينات اندماجي باستخدام كريسبر/Cas9 والنوكليوتيد المفرد-الذين تقطعت بهم السبل هو استراتيجية فعالة لتصحيح الطفرات قاعدة واحدة، التي غالباً ما تكون مسؤولة عن مجموعة متنوعة من الاضطرابات الموروثة البشرية. باستخدام نظام راسخ نموذج يستند إلى الخلية، تم إصلاح نقطة تحول جينة واحدة-نسخة متحولة اجفب دمج الخلايا HCT116 استخدام هذا النهج التوافقي. ويكشف تحليل الخلايا المصححة وغير المصححة الدقة في تحرير الجينات وتطوير الآفات الوراثية، عندما يتم إنشاء إينديلس في الخلايا التي تم تصحيحها في تسلسل الحمض النووي المحيطة بالموقع المستهدف. ويرد هنا، المنهجية المحددة المستخدمة لتحليل هذا النهج التوافقي لتحرير طفرة نقطة، مقترنة باستراتيجية تجريبية مفصلة على قياس تشكيل إينديل في الموقع المستهدف، والجينات. ويوجز هذا البروتوكول إلى نهج التأسيسية وسير التحقيقات الرامية إلى تطوير الجينات كريسبر/Cas9-على أساس تحرير للعلاج البشري. اختتام هذا العمل أن الطفرات في الموقع يحدث نتيجة نشاط كريسبر/Cas9 أثناء عملية إصلاح طفرة نقطة. ويضع هذا العمل في مكان منهجية موحدة لتحديد درجة الطفرات، التي ينبغي أن تكون جانبا هاما وحاسما لأي نهج متجهة إلى تنفيذ السريرية.
دور رائد في الدراسات قبل مانديكي (1986) أظهر تغييرات دائمة في الحمض النووي بلازميد استخدام النوكليوتيد تتحول البكتيريا1، بينما الدر والدر (1986) الاضطلاع بدراسات مماثلة في الخميرة2. بعد ذلك بقليل، شيرمان والزملاء نشر سلسلة من الورقات التي أدخلت النوكليوتيد المفرد-الذين تقطعت بهم السبل في خلايا الخميرة إجراء تغييرات الموروثة في الجينات3. بناء على العمل المنوي في الخلايا الجرثومية، بدأ Kmiec والزملاء تطوير النوكليوتيد وكيل واحد فريدة من نوعها التي توجه إصلاح قاعدة واحدة في خلايا الثدييات4. هذا المفهوم قد استند إلى بيانات البيوكيميائية التي أظهرت أن الجزيئات التي تحمل الحمض النووي الريبي ربط شكل مشدود أكثر إلى الموقع المستهدف من تلك التي تتكون كلية من قواعد الحمض النووي. على الرغم من أن هناك تقارير عديدة عن نجاح تحرير الجينات باستخدام النوكليوتيد تشيميريك5،،من67، تحرير مستويات ظلت اختلافاً كبيرا بين تجارب وعبر مختلف/الخلية الهدف تركيبات.
الحمض النووي المانحين الذين تقطعت بهم السبل–واحد المفضل للمانحين مزدوج تقطعت الحمض النووي لأنها أقل عرضه لدمج مواقع داخل الجينوم8بشكل عشوائي. أدخلت مناشئ واحد-الذين تقطعت بهم السبل النوكليوتيد غير المعرضة للتدهور السريع قبل نوكلياسيس الخلوية. وقد استخدمت عدة استراتيجيات لحماية تيرميني النوكليوتيد من التدهور. الحمض النووي المحمية [ااكسونوكلس]، واحد-الذين تقطعت بهم السبل التي تحتوي على تسلسل المطلوب كان كافياً للحصول على كفاءة تحرير 0.1-1% مجموعة6. تحسنت وتقنيات تعداء أكثر اتساقا، مقترنة بقراءات المظهرية، يسمح لأكثر اتساقا التحرير بواسطة عدة بحوث المجموعات8،9،10،11، ،من 1213.
على مدى السنوات العشر الماضية، كان هناك جهدا كبيرا لجعل الخلايا المستهدفة أكثر قابلية لتحرير الجينات. استراتيجية واحدة توظف تحوير15،،من1416دورة الخلية. أثناء تحرير ترددات تحت شروط رد فعل طبيعي مع النوكليوتيد المفرد-الذين تقطعت بهم السبل (سودنس) أدخلت خلايا الثدييات مثقف تراوحت بين 0.1% و 1% على الترددات الجينات تحرير زيادة عند ما بين 3 إلى 5 إضعاف في النوكليوتيد أدخلت في الخلايا أثناء انتقالها من خلال المرحلة S. أظهر Brachman و Kmiec (2005) في سلسلة منفصلة من التجارب، أنه تم الحصول على مستويات عالية نسبيا من الجينات الدقيقة تحريرها (3-5%) عندما كان المحتضنة 2 ‘3’ ديديوكسيسيتوسيني (ddC) في الخلايا ل 24 ساعة قبل إضافة اليغنوكليوتيد17 . ddC يقلل من معدل حركة شوكة النسخ المتماثل من الحمض النووي، مما يوحي بأن التحرير الجينات بواسطة سودنس في استنساخ الخلايا يحتمل ينطوي على إدماج أودنس في مناطق من النسخ المتماثل النشط11،18. أخذت معا، هذه الدراسات أدت إلى مفهوم أن المانحين الحمض النووي يصبح تدمج شوكة النسخ متماثل المتنامي كجزء من إليه حقيقية للعمل لتحرير الجينات، مستقلة عن ما إذا كان هذا فاصل مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل أو لا19. وهكذا، تصحيح طفرة نقطة أو الاستعاضة عن جزء من الحمض النووي داخل الكروموسوم يحدث عن طريق الأقران الحمض النووي ومسار واحد-حبلا الاستيعاب.
حمل عشوائي فواصل الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل في زراعة الخلايا مع وكلاء جزيء صغير يخلق بيئة التي تعطل الحمض النووي الأحداث النسخ المتماثل الخلية محاولات لإصلاح الضرر20،21. هذا التباطؤ عابرة من شوك النسخ المتماثل يمكن اختراق أكثر كفاءة هيكل الكروماتين النوكليوتيد التحرير واحد-الذين تقطعت بهم السبل، تحسين إمكانية الوصول إلى الهدف15. فواصل إنشاء الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل بالمخدرات مثل VP16، بليوميسين، أو كامبتوثيسين22،23، لقد ثبت لتحفيز الجينات تحرير مستويات بما يقارب 10 إضعاف، يصل إلى 6-8%. ومع ذلك، تكون فواصل الحمض النووي مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل عشوائية غير مرغوب فيها في أجواء علاجية.
الجينات التحرير مع نوكليسيس للبرمجة والنوكليوتيد أيضا حفز خلال انقسام الخلية24،25. عندما تستخدم التسليم على أساس الحمض النووي القيام بإصلاح الموجه من التماثل في تزامن HCT 116 الخلايا، أظهر ريفيرا-توريس والزملاء نفس الزيادة في استهداف النشاط عند النسخ المستجيب المنشط–مثل نوكليسيس (تالينس) كانوا يعملون مع النوكليوتيد المفرد-الذين تقطعت بهم السبل، سواء أدخلت26،سكان27 خلية تكرار. في الآونة الأخيرة، أظهرت بيالك والزملاء أن إصلاح الطفرات قاعدة واحدة مع النوكليوتيد المفرد-الذين تقطعت بهم السبل ومجموعة واسعة من مجمع يكرر المتناوب قصيرة بانتظام إينتيرسباسيد Cas9 (كريسبر/Cas9) جزيئات تجري بكفاءة أعلى عندما يتم عبور السكان خلية S المرحلة28. جزيء كريسبر يتكون من الحمض النووي الريبي والوظائف لتحديد المنطقة ضمن الهدف تسلسل الحمض النووي الذي تم تعيينه للانقسام. Cas9 هو إنزيم البكتيري الذي تتمثل وظيفته في تنشق الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل في رد فعل تبادل نوكليوليتيك. وهكذا، كريسبر المواقف المعقدة على الهدف الجينوم، وينفذ نوكلياسي Cas9 كسر مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل. لين et al. (2014) كما أظهرت أهمية دورة الخلية لتحقيق الترددات العالية من الجينات التحرير، باستخدام ريبونولسيوبروتين (رنب) كريسبر/Cas9 تعديل مجمع بوساطة نظام تسليم في الابتدائي الولدان الليفية، الخلايا الجذعية الجنينية البشرية، و أخرى خطوط الخلية24. وهكذا، العلاقة بين تحرير الجينات وتقدم دورة الخلية لتحرير الجينات عامل واحد ينطبق على الجينات اندماجي تحرير باستخدام نوكليسيس القابلة للبرمجة وقوالب الحمض النووي المانحين. بينما جمعت بين مجموعة متنوعة من الشركاء مع قالب الحمض النووي المانحة النهج التوافقي لتحرير الجينات، استخدم معظم العاملين في الحقل كريسبر/Cas9 لتوفير وظيفة كسر مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل. يتوقف هذا الاختيار السهولة استخدام هذه الأداة الوراثية خاصة والمرونة التي يمكن أن تستخدم لتعطيل وظيفة الجينات أو إدخال قطعة خارجية من الحمض النووي في موقع معين. من الناحية الفنية أسهل مقارنة مع توليد بالضربة القاضية لاستبدال جينات، حيث إدراج نسخ “تصحيح” أو العادي من الجينات في موقع المرض يجب أن تنفذ بدقة. تحديد عدد من الباحثين ودراسة استخدام الأدوية المحددة والمواد الكاشفة التي تمكن من تصحيح القواعد المسخ والإدراج من التسلسل الجيني العادي في الموضع المناسب في ترددات مرتفعة29.
ومؤخرا، ريفيرا-توريس et al. 30 استخدام الجينات اندماجي التحرير، مع استفادة نشاط نظام كريسبر/Cas9 مصممة خصيصا والمعلومات الوراثية المقدمة من قالب الحمض النووي مانحة اليغنوكليوتيد واحد-الذين تقطعت بهم السبل، لإصلاح كسر مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل نقطة تحول فيدمج نسخة واحدة من الجينات المحسنة الفلورسنت الأخضر البروتين (اجفب) في الخلايا HCT116. استغل أصحاب هذا الخط خلية نموذج جيد يتسم بتقييم الطابع الخاص للانقسام والمحيطة بالموقع المستهدف. وتكشف البيانات وجود عدم تجانس في الموقع المستهدف، خاصة في الخلايا التي لا تحتوي على نقطة تحور المصوبة. في هذه المخطوطة، بالتفصيل، والتركيز على المنهجية التي يستخدمها هؤلاء العمال للنظر في الموقع عدم التجانس حيث تم إنشاؤها بواسطة تحرير الجينات كريسبر/Cas9.
وبرز الجينات تحرير انضباط علمي السائد أساسا بسبب ظهور نظام كريسبر/Cas9. هذا المسار ملحوظا، مما يسهل الحصانة التبني في الخلايا البكتيرية، قد تم إعادة توجيه الغرض منه كأداة جزيئية لتمكين تغيير الجينوم في الكروموسومات البشرية. الوظيفة الطبيعية كريسبر/Cas9 لتعطيل الحمض النووي الفيروسي بإدخال فواصل الحمض النووي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل المؤدية إلى تجزئة30،31. هذا النشاط يؤدي إلى تدمير الغازية خارجية الحمض النووي ويؤدي إلى حصانة بدائية أن يمنع الإصابة اللاحقة بالجسيمات الفيروسية نفسها. مثير للدهشة، أن هذا النظام يسلك سلوك الرئوي، في ذلك فإنه يمكن إعادة تنشيط جرنا كريسبر معينة تم إنشاؤها بواسطة أحداث الإصابة السابقة.
كفاءة ودقة من تعطيل الجينات التي تحفزها كريسبر/Cas9 قد استخدمت في العديد من النظم الوراثية حقيقية النواة حيث كان الهدف تعطيل32،جينات عاملة33. عندما خفضت إلى مستوى القاعدية، العملية تتكون من اثنين من الخطوات الأساسية. الأول كسر مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل، بينما الثاني يعتمد على عملية المتأصلة لنهاية غير المتجانسة الالتحاق بالعمل (نج) لإتمام الدفع. في معظم الحالات، نتائج كسر مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل في إيجاد بلانت-انتهى، أجزاء الكروموسومات المخلاة، والأنزيمات المشاركة في نج الرد على كسر الصبغية والعمل على ضم نهايات مكسورة. يمكن أن تشمل هذه العملية في بعض الأحيان فقدان النيوكليوتيدات فردية في موقع مقطوعة. يمكن أن يسبب فقدان قواعد قليلة حتى فراميشيفت، وتوقف عن التعبير الوظيفي. استخدام كريسبر/Cas9 لإنشاء الوراثية بالضربة القاضية بالانخراط في عملية طبيعية من نج ثورة حقيقية النواة علم الوراثة؛ فقدان الحمض النووي في موقع الهدف المتوقع ويمكن التنبؤ به على حد سواء.
وعلى النقيض من الجينات بالضربة القاضية، انخرطت عدد من الباحثين في محاولة لإعادة توجيه وإعادة توظيفها النشاط كريسبر/Cas9 تجاه عملية الإصلاح الموجه من التماثل. والهدف من هذه الدراسات تصحيح الجينات. في هذه الاستراتيجية، هو كريسبر/Cas9 جنبا إلى جنب مع قالب الحمض النووي الجهات مانحة التي توفر المعلومات الوراثية لإصلاح خطأ خلقي أو لإدراج الطفرات في جينات صحية. وأفادت التقارير المبكر تسليط الضوء على قدرة كريسبر/Cas9 ملحوظة حفز إصلاح موجه التماثل (مباشرة أو غير مباشرة) أن العملية وقعت في24،أزياء عالية دقة34. المختبر بدراسة الإصلاح الموجه بالتماثل أو تصحيح الجينات باستخدام النوكليوتيد المفرد-الذين تقطعت بهم السبل في محاولة لتحديد الآلية والتنظيمية الدوائر المحيطة به15،17،18 ،23. وقد ركزنا أساسا على الجينات تحرير الطفرات نقطة واحدة، لأن هذا هو الطفرات الوراثية الأساسية المعروفة لتكون مسؤولة عن العديد من الاضطرابات الموروثة. لدينا المعرفة الأساسية لتحرير الجينات أدت بنا إلى سؤال دقة النشاط كريسبر/Cas9 في ردود الفعل هذه، منذ الدالة كريسبر/Cas9 في الجينات نتائج خروج المغلوب في تشكيل إينديلس. استخدمنا نظام نموذجي واضحة المعالم، بدلاً من جينات ذات الصلة سريرياً بعد غير انتقائية، لدراسة الطفرات في الموقع بطريقة اختزالية بلا ريب. باستخدام جينات مستهدفة بسيطة، بناء على الجينات التي يمكن أن يقاس التصويب على الصعيدين أوضح والمظهرية، نحن مسبب أن التغاير التي تحدث في الموقع المستهدف يمكن تحديدها بطريقة موثوقة وقوية.
البيانات المتوفرة لدينا تؤكد أن الجينات راسخة تحرير النظام، تتألف من اجفب متحولة الجينات دمج الخلايا HCT116، يمكن معلومات التأسيسية فيما يتعلق بتوليد الآفات الوراثية والعملية من الطفرات في الموقع. جزيئات الحامض النووي المانحة اليغنوكليوتيد كريسبر/Cas9 والذين تقطعت بهم السبل–واحدة تعمل في ترادف يمكن أن يؤدي إلى إصلاح نقطة الطفرة في الجين اجفب دقيقة. نحن نقترح نموذجا جديداً لإصلاح الطفرات، طريقا جزيئية التي يعمل الحمض النووي المانحة كقالب النسخ متماثل لإصلاح قاعدة متحولة، عملية ونحن قد وصف الدقيقة30. السكان المستهدفين، لا العارضة النمط الظاهري المصوبة، يعرض مجموعة متنوعة من الخلايا التي تحتوي على غير متجانسة وعلى نطاق واسع بدءاً من الحمض النووي إينديلس المحيطة بالموقع المستهدف. في ما يقرب من نصف المستنسخين معزولة عن السكان التي لم يتم تصحيحها، لوحظ الطفرات الحذف في الموقع المستهدف. أبدت لا تقرير سابق أن النوكليوتيد المفرد-الذين تقطعت بهم السبل بوصفها أدوات تحرير الجينات عامل واحد يمكن أن يستحث إينديلس في الموقع المستهدف، نستنتج أن النشاط كريسبر/Cas9 المسؤولة عن هذه التحولات.
في هذه المخطوطة، نحن نقدم منهجية مفصلة حيث أنه يمكن أن يقاس التغاير الوراثي في الموقع المستهدف بطريقة موثوقة وقوية. وفي حين يولي قدرا كبيرا من الاهتمام للتحليل ورسم الخرائط من الطفرات خارج الموقع، فمن المرجح أن طفرة غير متجانسة التي تم إنشاؤها في موقع الهدف سوف يكون لها تأثير أكبر على النجاح أو الفشل للجينات التحرير في الساحة السريرية. قد تكون تقنيات إضافية أو معدلة Cas9 البروتينات المطلوبة لتحسين دقة إصلاح أخطاء وراثي في خلايا الثدييات35الموجه من التماثل. بعض هذه التقنيات تشمل استخدام النوكليوتيد الإضافية يكون بمثابة جسر، عقد نهايات الكروموسومات معا، وتجنب الإجراءات المدمرة من نج. تحديد درجة التباين في الموقع المستهدف نتيجة نشاط الجينات–تحرير ويجب أن تكون جزءا هاما من أي بروتوكول مصمم للتدخل العلاجي.
The authors have nothing to disclose.
المؤلفين قد لا إعلامات.
McCoy’s 5A Modified medium | ATCC | 30-2007 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC | 30-2020 | |
L-glutamine | ATCC | 30-2214 | |
Penicillin-Streptomycin Solution | ATCC | 30-2300 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | ATCC | 30-2200 | No Calcium or magnesium |
Trypsin EDTA Solution | ATCC | 30-2101 | |
Aphidicolin 1mg | Thermo Fisher | AC611970010 | |
Alt-R CRISPR crRNA, 10 nmol | IDT | No catalog number since its made to your specific gene target. | |
CRISPR-Cas9 tracrRNA, 20 nmol | IDT | 1072533 | |
S.p. Cas9 Nuclease 3NLS, 500 µg | IDT | 1074182 | |
IDTE Buffer | IDT | 11-01-03-01 | |
Zeus Electroporation Cuvettes 0.4 Cm | VWR | 10497-474 | |
Gene Pulser Xcell Electroporation Systems | BioRad | 1652660 | |
Bovine serum albumin lyophilized powder, crystallized, ≥98.0% (GE) |
Sigma | 05470-1G | |
EDTA (0.5 M), pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | AM9260G | |
Propidium Iodide – 1.0 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | Qiagen | 69581 | |
6-well Standard Line Multiwell Cell Culture Plates | VWR | 10062-892 | |
Petri Dishes | Fisher | 12-565-90 | |
Conical Tubes (15 mL) (racked) | Thermo Fisher | AM12500 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 |