Dissectie van menselijke netvlies en RPE-vaatvlies voor proteoom-analyse

Summary

Het menselijke netvlies is samengesteld uit functioneel en moleculair verschillende regio’s, met inbegrip van de fovea, macula en perifere retina. Hier beschrijven we een methode met behulp van punch biopsieën en handmatig verwijderen van de lagen weefsel van een menselijk oog te ontleden en deze verschillende retinale regio’s voor downstream Proteoom analyse te verzamelen.

Abstract

Het menselijke netvlies is samengesteld uit de sensorische neuroretina en de onderliggende retinale pigment epitheel (RPE), die is stevig complexvorm aan de vasculaire choroideus laag. Verschillende regio’s van het netvlies zijn anatomisch en moleculair verschillend, vergemakkelijking van unieke functies en demonstreren van differentiële gevoeligheid voor ziekte. Proteoom analyse van elk van deze regio’s en lagen kan belangrijke inzicht verwerven in de moleculaire proces van vele ziekten, waaronder Age-Related macula degeneratie (LMD), diabetes mellitus en glaucoom. Scheiding van retinale regio’s en lagen is echter noodzakelijk voordat kwantitatieve Proteoom-analyse kan worden bereikt. Hier beschrijven we een methode voor dissectie en verzameling van de foveal, macula en perifere Retina regio’s en onderliggende RPE-vaatvlies complex, waarbij regionale punch biopsieën en handmatig verwijderen van de lagen weefsel van een menselijk oog. Eendimensionale SDS-pagina evenals downstream Proteoom analyse, zoals vloeibare chromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS), kan worden gebruikt voor identificatie van eiwitten in elke ontleed retinale laag, moleculaire biomarkers voor retinale ziekte onthullen.

Introduction

Het netvlies, vaatvlies en RPE zijn complexe weefsels waaruit belangrijke regionale verschillen in eiwit expressie, fysiologische functie en pathologische gevoeligheden^1,2. Bijvoorbeeld, tonen ziekten zoals Age-Related macula degeneratie (LMD), retinitis pigmentosa en centrale sereuze retinopathie elke karakteristiek localisatie binnen de fovea, macula of netvlies periferie^{1,3, 4,6}. Hier presenteren we een methode aan te tonen hoe verschillende retinal regio’s kunnen onafhankelijk worden bemonsterd. Het algemene doel van deze methode is een betrouwbare gids om te verzamelen van weefselmonsters uit de foveal, macula en perifere gebieden van de menselijke netvlies en RPE-vaatvlies voor proteoom-analyse. De reden voor de ontwikkeling en het gebruik van deze techniek is dat door middel van Proteoom analyse van deze specifieke retinale gebieden, belangrijke moleculaire inzichten kunnen worden verkregen tot de functies van het fysiologische en pathofysiologische van deze regio’s.

Deze aanpak belooft te onthullen de proteomic-basis voor relatieve regionale ziekte gevoeligheden, en de identificatie van nieuwe specifieke therapeutische doelen te vergemakkelijken. Inderdaad, proteomic onderzoeken van het glasvocht en zijn interacties met het netvlies hebben verstrekt belangrijke inzichten in de moleculaire samenstelling en functie van gezonde en zieke weefsel^{5,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13}. echter, duidelijke vergelijkende proteomic analyses van verschillende retinale gebieden ontbreken. De techniek helpt ter ondersteuning van deze broodnodige studies, bieden voordelen ten opzichte van andere methoden door het tonen van een betrouwbare en reproduceerbare weefsel collectie aanpak. Meer nog, de aanpak is heel toegankelijk, profiteren van standaardformaat en gemakkelijk beschikbaar weefsel punch biopsie tools. Onze techniek benadrukt de juiste inzameling en opslag van weefsels voor proteomic verwerking, waardoor belangrijke overwegingen voor eiwitstabiliteit en afbraak. Dus, deze methode is meest geschikt voor onderzoekers downstream moleculaire analyse van proteomic factoren te overwegen.

Protocol

deze studie werd goedgekeurd door de Universiteit van Iowa ' s institutionele Review Board en houdt zich aan de beginselen die zijn uiteengezet in de verklaring van Helsinki. 1. Foveal en Macula Biopsy Punch Open en vlinder het menselijk oog, zodanig dat het bestaat uit 4 aparte flappen van weefsel, zoals beschreven in een eerdere publicatie. 5 beginnen met een butterflied menselijk oog geplaatst in een petrischaal, een 4-mm punch biopsie tool …

Representative Results

Retina en RPE-vaatvlies weefsel kunnen op verschillende manieren aan een afzonderlijk onderzoek worden verwerkt. Na het verzamelen bezitten de onderzoeker monsters van de retina en RPE-vaatvlies weefsel uit de foveal regio, buitenste macula en perifere retina (Figuur 1). In het bijzonder zal de foveal regio punch omvatten de fovea, de parafovea en een kleine hoeveelheid van de aangrenzende perifovea. De macula punch omvat de rest van de perifoveal-regio evena…

Discussion

Na weefsel zijn collectie, sample handling en behandeling cruciaal overwegingen¹⁴. Behoud in vloeibare stikstof heeft de voorkeur boven chemische fixatie, zoals de laatste kan resulteren in schade aan eiwitstructuur, die stroomafwaarts analyse kan scheeftrekken. Daarnaast is de vloeibare stikstof behoud aangenamer zijn wanneer u de methoden die geen bevriezing van monsters. Met name Ferrer et al. toonde significante verschillen in eiwitniveaus tussen hersenen monsters bewaard bij 4 ° C o…

Materials

4-mm skin punch biopsy tool	Miltex	REF 33-34
8-mm skin punch biopsy tool	Miltex	REF 33-37
0.12 Colibri Forceps	Stephens Instruments	S5-1145
Wescott Scissors	Sklar Surgical Instruments	64-3146
Microfuge tubes	Eppendorf	#022364111	1.5 mL
Liquid Nitrogen	Praxair, Inc.	7727-37-9 [R]