Dissezione della Retina umana e RPE-coroide per analisi proteomica

Summary

La retina umana è composta in modo funzionale e molecolare distinte regioni, tra cui la fovea, la macula e la retina periferica. Qui, descriviamo un metodo utilizzando biopsie punch e rimozione manuale di strati di tessuto da un occhio umano per sezionare e raccogliere queste regioni distinte della retina per analisi proteomica a valle.

Abstract

La retina umana è composto della neuroretina sensoriale e il sottostante dell’epitelio pigmentato retinico (RPE), che è saldamente complessato allo strato coroidico vascolare. Diverse regioni della retina sono anatomicamente e molecolare distinte, facilitando funzioni uniche e dimostrando la suscettibilità alla malattia. Analisi proteomica di ciascuna di queste regioni e strati possono fornire le comprensioni vitale nel processo molecolare di molte malattie, compreso degenerazione Macular relativa all’età (AMD), mellito di diabete e il glaucoma. Tuttavia, separazione delle regioni retiniche e strati è essenziale prima analisi proteomic quantitativa possono essere compiuta. Qui, descriviamo un metodo per la dissezione e la collezione delle regioni retiniche foveale, maculare e periferiche e sottostante RPE-coroide complesso, che coinvolge le biopsie del punzone regionali e rimozione manuale di strati di tessuto da un occhio umano. Unidimensionale SDS-PAGE, nonché analisi proteomica a valle, come liquida cromatografia-spettrometria di massa (LC-MS/MS), possono essere utilizzato per identificare le proteine in ogni strato retinico dissecata, rivelando biomarcatori molecolari per malattia retinica.

Introduction

La retina, RPE e coroide sono tessuti complessi che mostrano importanti differenze regionali nell’espressione della proteina, funzione fisiologica e patologica predisposizioni^1,2. Per esempio, malattie come la degenerazione Macular relativa all’età (AMD), retinite pigmentosa e retinopatia sierosa centrale dimostrano caratteristica localizzazione all’interno della fovea, macula o retina periferia^{1,3, 4,6}. Qui, presentiamo un metodo dimostrando retinico come distinta regioni possono essere campionate in modo indipendente. L’obiettivo generale di questo metodo è quello di fornire una guida affidabile per la raccolta di campioni di tessuto dalle regioni foveale, maculare e periferiche della retina umana e RPE-coroide per analisi proteomica. La spiegazione razionale per lo sviluppo e l’uso di questa tecnica è che attraverso analisi proteomica di queste regioni specifiche della retina, importanti intuizioni molecolare possono essere acquisite nelle funzioni fisiologiche e fisiopatologiche di queste regioni.

Questo approccio promette di rivelare la base di proteomica per la suscettibilità relativa malattia regionale e di facilitare l’identificazione di nuovi bersagli terapeutici specifici. Infatti, le indagini di proteomica del vitreo e delle sue interazioni con la retina hanno fornito spunti preziosi per la composizione molecolare e la funzione del tessuto sano e malato^{5,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13}. Tuttavia, analisi proteomica comparativa chiaro di distinte regioni retiniche sono carenti. La tecnica contribuirà a sostenere questi studi tanto necessaria, fornendo vantaggi rispetto ad altri metodi dimostrando un approccio di raccolta del tessuto affidabili e riproducibili. Più così, l’approccio è molto accessibile, approfittando del punzone di tessuto di dimensioni standard e prontamente disponibili strumenti di biopsia. La nostra tecnica enfatizza l’appropriata raccolta e conservazione dei tessuti per proteomica elaborazione, facendo considerazioni importanti per la stabilità proteica e degradazione. Così, questo metodo è più adatto per gli investigatori considerando l’analisi molecolare a valle di proteomica fattori.

Protocol

questo studio è stato approvato dall’Università dell’Iowa ' s Institutional Review Board e aderisce ai principi stabiliti nella dichiarazione di Helsinki. 1. Foveal e maculare biopsia Punch Open e farfalla l’occhio umano, tale che si compone di 4 distinti lembi di tessuto, come descritto in una precedente pubblicazione. 5 a partire da un occhio umano butterflied inserito in una capsula Petri, centro uno strumento di biopsia del punzone da 4 m…

Representative Results

Tessuto di RPE-coroide e della retina possono essere elaborati in vari modi per soddisfare un’indagine individuale. Dopo la raccolta, il ricercatore sarà in possesso di campioni di tessuto RPE-coroide dalla regione foveal, macula esterno e retina periferica (Figura 1) e della retina. In particolare, il pugno di regione foveal includerà la fovea, il parafovea e una piccola quantità del perifovea adiacente. Il punzone maculare include il resto della regione …

Discussion

Dopo tessuto raccolta, manipolazione e trattamento sono cruciali considerazioni¹⁴. Conservazione in azoto liquido è preferibile fissazione chimica, come quest’ultimo può causare danni alla struttura della proteina, che potrebbe inclinare analisi a valle. Inoltre, la conservazione in azoto liquido è preferito ai metodi che non comportano congelamento di campioni. In particolare, Ferrer et al hanno evidenziato differenze significative nei livelli della proteina tra cervello campioni cons…

Materials

4-mm skin punch biopsy tool	Miltex	REF 33-34
8-mm skin punch biopsy tool	Miltex	REF 33-37
0.12 Colibri Forceps	Stephens Instruments	S5-1145
Wescott Scissors	Sklar Surgical Instruments	64-3146
Microfuge tubes	Eppendorf	#022364111	1.5 mL
Liquid Nitrogen	Praxair, Inc.	7727-37-9 [R]