Disección de la Retina humana y RPE-coroides para análisis proteómico
Summary
La retina humana está conformada por las regiones funcionalmente y molecularmente distintas, incluyendo la fóvea, mácula y retina periférica. Aquí, describimos un método utilizando las biopsias del sacador y extracción manual de las capas de tejido de un ojo humano para diseccionar y recoger estas regiones retinianas distintas para análisis proteómico aguas abajo.
Abstract
La retina humana se compone de la neuroretina sensorial y el epitelio pigmentado retiniano subyacente (RPE), que es firmemente complexed a la capa vascular de la coroide. Diferentes regiones de la retina son anatómicamente y molecularmente distintas, facilitando funciones únicas y demostrar susceptibilidad diferencial a la enfermedad. Análisis proteómico de cada una de estas regiones y capas pueden proporcionar información vital sobre el proceso molecular de muchas enfermedades, incluyendo degeneración relacionada de Macular (AMD), diabetes mellitus y glaucoma. Sin embargo, la separación de capas y regiones retinianas es esencial antes de proceder con el análisis proteómico cuantitativo. Aquí, describimos un método de disección y recogida de la regiones retinianas periféricas, maculares y foveal y subyacente coroides RPE complejo, involucrando a las biopsias del sacador regional y extracción manual de las capas de tejido de un ojo humano. Unidimensional de SDS-PAGE, así como análisis proteómicos aguas abajo, como líquido cromatografía-tandem espectrometría de masas (LC-MS/MS), pueden utilizarse para identificar proteínas en cada capa retiniana disecada, revelar biomarcadores moleculares de la enfermedad retiniana.
Introduction
La retina, EPR y coroides son tejidos complejos que muestran importantes diferencias regionales en la expresión de proteínas, función fisiológica y patológica susceptibilidad1,2. Por ejemplo, enfermedades como la degeneración relacionada de Macular (AMD), retinitis pigmentosa y la retinopatía serosa central demuestran características localización dentro de la fóvea, mácula o retina periferia1,3, 4,6. Aquí, presentamos un método de demostración de retina cómo distinta regiones pueden ser muestreadas independientemente. El objetivo general de este método es proporcionar a una guía confiable para la recolección de muestras de tejido de las regiones periféricas, maculares y foveal de la retina humana y la RPE-coroides para análisis proteómico. El fundamento para el desarrollo y uso de esta técnica es a través de análisis proteómico de estas regiones retinianas específicas, importantes penetraciones moleculares pueden obtenerse en las funciones fisiológicas y fisiopatológicas de estas regiones.
Este enfoque promete revelar la base proteómicos para susceptibilidad de enfermedad regional relativa y para facilitar la identificación de nuevas dianas terapéuticas específicas. De hecho, las investigaciones proteómicas de vítreo y sus interacciones con la retina han proporcionado ideas claves en la composición molecular y función del tejido sano y enfermo5,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. sin embargo, se carecen de análisis proteómicos claro comparativo de distintas regiones retinianas. La técnica ayuda a apoyar estos estudios necesaria, ofreciendo ventajas sobre otros métodos demostrando un enfoque de la colección de tejido fiable y reproducible. Más aún, el enfoque es muy accesible, tomando ventaja de sacador de tejido de tamaño estándar y disponible herramientas de biopsia. Nuestra técnica hace hincapié en la adecuada recolección y almacenamiento de tejidos para proteómica de procesamiento, haciendo consideraciones importantes para la estabilidad de la proteína y la degradación. Así, este método es más apropiado para investigadores teniendo en cuenta posterior análisis molecular de factores proteómicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Después de tejido obtención muestra y tratamiento son consideraciones cruciales14. Conservación en nitrógeno líquido se prefiere sobre la fijación química, como este último puede resultar en daños a la estructura de la proteína, que podría sesgar el análisis descendente. Además, conservación de nitrógeno líquido se prefiere a los métodos que no implican la congelación de las muestras. En particular, Ferrer et al mostraron diferencias significativas en los niveles de prot…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
VBM es apoyado por subvenciones de NIH [K08EY020530, R01EY024665, R01EY025225, R01EY024698 y R21AG050437, Doris Duke Charitable Fundación Grant #: 2013103 y la investigación para evitar la ceguera (RPB), Nueva York, NY. MT y GV son apoyados por los NIH grant T32GM007337.
Materials
| 4-mm skin punch biopsy tool | Miltex | REF 33-34 | |
| 8-mm skin punch biopsy tool | Miltex | REF 33-37 | |
| 0.12 Colibri Forceps | Stephens Instruments | S5-1145 | |
| Wescott Scissors | Sklar Surgical Instruments | 64-3146 | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | #022364111 | 1.5 mL |
| Liquid Nitrogen | Praxair, Inc. | 7727-37-9 [R] |
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