Imagens ao vivo de migração de células epiteliais da mama após o esgotamento de transiente de TIP60
Summary
Aqui, apresentamos o monitoramento em tempo real de migração celular em um ensaio de cicatrização de feridas utilizando empobrecido TIP60 MCF10A mama células epiteliais. A implementação de técnicas de imagem de viver-pilha em nosso protocolo nos permite analisar e visualizar o movimento de célula única em tempo real e ao longo do tempo.
Abstract
O ensaio de cicatrização de feridas é eficiente e uma das formas mais econômicas para estudar a migração de células in vitro. Convencionalmente, imagens são tomadas no início e no fim de uma experiência usando um microscópio de contraste de fase, e as capacidades de migração das células são avaliadas pelo encerramento das feridas. No entanto, o movimento celular é um fenômeno dinâmico, e não permite um método convencional para controlar o movimento de célula única. Para melhorar o atuais ensaios de cicatrização de feridas, usamos técnicas de imagem ao vivo-celular para monitorar a migração celular em tempo real. Este método permite determinar a taxa de migração de células com base em um sistema de rastreamento de celular e fornece uma distinção mais clara entre a migração celular e proliferação celular. Aqui, vamos mostrar o uso da imagem latente da viver-pilha em cicatrização ensaios para estudar as capacidades diferentes de migração das células epiteliais da mama, influenciadas pela presença de TIP60. Como a motilidade celular é altamente dinâmica, nosso método fornece mais insights sobre os processos de cura do que um instantâneo de fechamento de ferida tomado com as técnicas tradicionais de imagem usadas para ensaios cicatrização de ferida.
Introduction
Proteína de HIV-Tat-interactive 60 kDa (TIP60) é uma acetiltransferase de lisina que pode acetificam tanto histona e proteínas não-histonas1,2. Suas funções são encontradas para ter implicações em múltiplas vias de sinalização, incluindo a transcrição, reparar os danos do DNA e apoptose1,3,4,5,6, 7 , 8. Além disso, TIP60 é frequentemente ativador em cânceres e seu downregulation está correlacionada com metástases e taxas de sobrevivência pobre9,10,11,12, 13,14. Metástase de tumor é a principal causa de morte por câncer. É um processo de várias etapa, e a etapa inicial da metástase envolve a migração e invasão de células tumorais em tecidos adjacentes15,16. Para isso, células tumorais primeiro devem desconectar-se da massa do tumor primário, sob a forma de uma camada de células coletivamente invasora ou como desanexado células únicas17. Durante este processo, células tumorais muitas vezes passam por epitélio de transição mesenquimal (EMT), resultando em mudanças na morfologia e célula adesão capacidade17,18.
Algumas técnicas foram desenvolvidas para estudar a migração e a capacidade de invasão do tumor em vitrode células. Entre eles, o ensaio de cicatrização de feridas é mais eficiente e econômica do19. Em primeiro lugar, este método envolve a criação de um fosso artificial em uma monocamada confluente das células, permitindo assim que as células migram e fechar a lacuna. Em segundo lugar, as imagens das lacunas podem ser capturadas no início e no final do experimento. Finalmente, uma comparação de fechamento de espaço é usada para determinar a taxa de migração celular. Um microscópio de contraste de fase é geralmente usado para capturar imagens para ensaios convencionais de cicatrização de feridas. Outra vantagem do ensaio cicatrização é que se assemelha em parte na vivo migração de células do tumor. Da mesma forma para metástases de tumor na vivo , migração celular em ensaios cicatrização mostra tanto a migração coletiva de folhas epiteliais e a migração de células únicas desanexadas.
No entanto, migração celular é conhecida por ser dinâmico, e há uma necessidade de documentar o movimento de células em tempo real. Por exemplo, um ensaio cicatrização convencional não permite que um pesquisador analisar o movimento de célula única. Por outro lado, células cultivadas para ensaios de cicatrização de feridas são muitas vezes soro de fome para inibir a proliferação celular. Isso é feito para descartar a possibilidade de encerramento de lacuna devido a proliferação celular. No entanto, ainda haverá alguns proliferação e morte celular e imagens de contraste de fase, tiradas antes e após o experimento são incapazes de diferenciá-las.
A técnica de imagem live-célula aborda essa limitação dos ensaios convencionais de cicatrização de feridas. Usando um microscópio de viver de imagem combinada com uma incubadora de CO2 e o controle de temperatura apropriado, pesquisadores podem medir o tamanho da lacuna e sua taxa de fechamento ao longo do tempo, enquanto o rastreamento do movimento de ativamente migrando células localizado nas pontas do parte dianteira invasiva. Daí, a implementação de viver-pilha de imagem para monitorar a migração celular só não irá fornecer a melhor visualização da migração celular, mas também permitirá a possibilidade de diferenciar entre migração celular e proliferação celular, proporcionando uma mais análise confiável de migração celular.
Neste estudo, MCF10A mama células epiteliais foram usadas para demonstrar a combinação do ensaio e viver-pilha de imagem para estudar o papel de TIP60 na migração celular-cicatrização da ferida. A depleção de TIP60 resulta em habilidades de aumento da migração de células MCF10A.
Protocol
Representative Results
Discussion
É sabido que, no processo de migração celular, células podem qualquer movimento em forma de folhas aderentes; clusters de soltos; ou células única, isoladas. O modo e a dinâmica de invasão celular podem variar de um estado para outro, e o fenótipo pode mudar dentro de horas. O tradicional ensaio de cicatrização de feridas é baseado no instantâneo fotos tiradas de um microscópio com um intervalo de tempo, como 12 ou 24 h. Isto torna difícil capturar a dinâmica de fechamento da ferida e o padrão dos movime…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos os membros do laboratório Jai de sua discussão útil e comentários. S.J. foi apoiado por subsídios desde a Fundação de pesquisa nacional de Singapura e o Ministério da educação de Cingapura sob seus centros de pesquisa da iniciativa de excelência para o câncer ciência Instituto de Singapore (R-713-006-014-271), a médica nacional Conselho de pesquisa (CBRG-NIG; BNIG11nov001 e CS-IRG; R-713-000-162-511), o fundo de pesquisa acadêmica do Ministério da educação (MOE AcRF Tier 1 T1-2012 Oct -04). Y.Z., G.S.C. e C.Y.T. foram apoiados por uma bolsa de pós-graduação pelo Instituto de ciência da câncer de Cingapura, Universidade Nacional de Cingapura.
Materials
| MCF10A cell | ATCC | CRL-10317TM | Breast epithelial cell |
| DMEM/F12 media (1:1) | Gibco | 11330-032 | MCF10A culture media |
| Epithelial growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Supplements for MCF10A culture media |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C-8052 | Supplements for MCF10A culture media |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0888 | Supplements for MCF10A culture media |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | Supplements for MCF10A culture media |
| House serum | Gibco | 16050-122 | Supplements for MCF10A culture media |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | For MCF10A detach from plate |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | For counting cell |
| Opti-MEM reduced serum media | Gibco | 31985-070 | For siRNA mixture |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies | 56532 | Transfect reagent |
| Trizol reagent | Invitrogen/Life Technologies | 15596-026 | For mRNA extraction |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | For cDNA generation |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5125 | For real time qPCR |
| 7500 Fast Real Time PCR system | Biosystems | Real time qPCR mechine | |
| 10-cm dish | Greiner bio-one | 664160 | For Knockdown experiment |
| 24-well plate | Cellstar | 662160 | For wound healing assay |
| siControl siRNA | Self designed | Self designed | CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT |
| siTIP60 siRNA | Self designed | Self designed | UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT |
| Live cell observer | Zeiss | Zeiss inverted Cell Observer for live cell experiments |
References
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