Microscopie intravitale de Monocyte Homing et axés sur la tumeur de l’angiogenèse dans un modèle murin de la maladie artérielle périphérique
Summary
Les monocytes sont des médiateurs importants d’arteriogenesis dans le contexte de la maladie artérielle périphérique. En utilisant une matrice de type membrane basale et la microscopie intravitale, ce protocole étudie monocyte autoguidage et axés sur la tumeur de l’angiogenèse après injection de monocytes dans le modèle murin de la ligature de l’artère fémorale.
Abstract
L’objectif thérapeutique pour la maladie artérielle périphérique et cardiopathie ischémique est d’augmenter le flux sanguin vers les zones ischémiques causées par une sténose hémodynamique. Chirurgie vasculaire est une option viable dans certains cas précis, mais pour les patients sans indication d’une intervention chirurgicale comme la progression de repos la douleur, une ischémie des membres critiques ou des perturbations majeures à la vie ou de travail, il y a peu de possibilités pour atténuer leur maladie. La thérapie cellulaire par perfusion de monocyte améliorée grâce à la stimulation de la formation collatérale est l’un des quelques options non invasives.
Notre groupe examine arteriogenesis après greffe de monocyte sur des souris en utilisant le modèle d’ischémie du membre postérieur. Auparavant, nous avons démontré amélioration de la perfusion du membre postérieur à l’aide de transplantation de monocyte syngénique stimulée par le tétanos. Outre les effets sur la formation de collatéraux, croissance tumorale pourrait être affectée par cette thérapie ainsi. Afin d’examiner ces effets, nous utilisons un modèle de souris de membrane basale comme matrice en injectant de la matrice extracellulaire de la sarcome Engelbreth-Holm-essaim dans le flanc de la souris, après l’occlusion de l’artère fémorale.
Après les études de tumeur artificiel, nous utilisons la microscopie intravitale pour étudier in vivo -angiogenèse tumorale et monocytes homing dans les artères collatérales. Des études antérieures ont décrit l’examen histologique des modèles animaux, ce qui suppose l’analyse post mortem d’artefacts. Notre approche visualise homing monocyte aux zones de nantissement en temps réel de séquences, est facile à réaliser et étudie le processus d’arteriogenesis et tumeur angiogenèse in vivo.
Introduction
Les maladies cardiovasculaires, y compris les maladies coronariennes ou la maladie artérielle périphérique, sont les causes les plus fréquentes de décès dans le monde1. La thérapie cellulaire est une approche prometteuse pour traiter les maladies cardiovasculaires, en particulier pour les personnes qui ne sont pas capable de subir des interventions chirurgicales. Il existe plusieurs approches à utiliser des cellules ou leurs substances sécrétées comme un outil thérapeutique2,3, dans le but d’améliorer la perfusion et de maintenir la fonction du tissu ischémique et y. Une tentative pour atteindre cet objectif est d’améliorer les arteriogenesis, qui favorise le développement des artères collatérales. Les monocytes sont un type de cellules importantes associé de nantissement. Notre groupe a mis l’accent sur la recherche sur les effets des monocytes dans les zones d’inflammation4,5, en particulier en utilisant le modèle d’ischémie du membre postérieur pour induire une ischémie et inflammation subséquente6. Monocytes abritent des zones d’inflammation et causent des réactions systémiques complexes qui conduisent à l’élaboration de collatéralisation7.
Avec l’utilisation de la microscopie intravitale, nous pouvons étudier le comportement de ces cellules en vivo et observer le homing des monocytes injectées aux zones d’inflammation. La plupart des études anciennes décrivent seulement les analyses post-mortem , qui détiennent les inconvénients, y compris une introduction d’artefacts histologiques et un grand nombre d’animaux requis pour les préparations. Grâce à notre approche, nous pouvons étudier les processus immunologiques et collatérale formation via live d’imagerie à plusieurs points dans le temps.
Outre le développement des artères collatérales en zones ischémiques, monocytes influencent également la croissance tumorale. Pour étudier ces processus, nous injecter une matrice de type membrane basale extraite du sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm, une tumeur riche en protéines de la matrice extracellulaire8et d’analyser à l’aide de la microscopie intravitale. Cette matrice est utilisée pour des molécules de test de l’écran pour formation de réseau cellulaire endothéliale ou anticancéreux par inhibition angiogénique ; dans ce cas, nous évaluerons le potentiel angiogénique de tumeur des monocytes pour cell therapy9,10,11.
Ce protocole vise à démontrer de manière simple et efficace pour étudier les processus immunologiques causées par une ischémie dans un modèle in vivo . Nous pouvons générer un environnement de test plus réaliste par rapport au bilan histologique des post-mortem des tissus musculaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode décrite ici met en lumière le développement des artères collatérales, le comportement des monocytes dans ces vaisseaux et le processus d’arteriogenesis. Les mesures d’application du présent protocole sont faciles à apprendre et peut être utilisé dans d’autres domaines de la science. Malgré ces avantages, il y a quelques inconvénients. Par exemple, équipement microscopique est tenu d’exécuter les techniques décrites. Obtention de matériel pour une expérience n’est pas viable, il est d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la ELSE-Kröner-Stiftung et le SFB DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, Fondation de recherche allemande) 854 (Sonderforschungsbereich, centre de recherche en collaboration). Merci à Hans-Holger Gärtner, Audiovisuelles Medienzentrum, Université Otto-von-Guericke de Magdeburg, Magdebourg (Allemagne), pour le support technique.
Materials
| 10% fetal calf serum (FCS) | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1% penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1mL Omnifix -F insuline syringe | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
| 50 ml syringe | Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Germany | Injectomat- syringe 50 ml with canule | |
| 6-well-ultra-low-attachement-plates | Corning Incorporated, NY, USA | ||
| 8- 12 week old, male, C57BL/6, BalbC mice | Charles River, Sulzfeld, Germany | ||
| Adhesive tape | TESA SE, Hamburg, Germany | ||
| Acquisition Software | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); Version: 2.7.3.9723 | |
| Canules | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 29G, 30G | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Cell culture medium | Manufactured by our group with single components | Medium199, 10% Fetal calf serum, 1% Antibiotic (penicillin/streptomycin) | |
| Centrifuge | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany | Allegra X-15R centrifuge | |
| Depilatory cream | Veet, Mannheim, Germany | ||
| DiO | Invitrogen Eugene, Oregon, USA | ||
| Disinfection agent | Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany | ||
| Disposable scalpel No.10 | Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan | ||
| EDTA | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Erlenmeyer flask | GVB, Herzogenrath, Germany | ||
| Ethanol 70% | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany | ||
| Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Fine Forceps | Rubis, Stabio, Switzerland | ||
| Flurophor/Rhodamindextran | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA | Katalognummer: D-1819 | |
| Gloves | Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany | ||
| Heating pad | Labotect GmbH, Göttingen, Germany | Hot Plate 062 | |
| Human macrophage-colony stimulating factor | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | SRP3110 | |
| Humane leucocyte filters | Blood preservation | ||
| Incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | ||
| Isoflurane | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
| Ketamine (10%) | Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin , Germany | ||
| Leukocyte separation tubes (tubes with filter) | Bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Light microscope | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany | Axiovert 40 C | |
| Lymphocyte separation medium LSM1077 | GE Healthcare, Pasching, Austria | ||
| Matrigel | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | ||
| Medium M199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria | ||
| Microbiological work bench | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany | Hera safe | |
| Microscope slide | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | Art. Nr. 1879 | |
| Microscope stand with incubator and heating unit | Leica DMI 6000, Pecon, Germany | ||
| Monocyte wash buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA | |
| Mouse restrainer | Various | ||
| Multi-photon microscope | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica SP5 Confocal microscope, Cameleon, Coherent | |
| NaCl (0,9%) | Berlin Chemie AG, Berlin, Germany | ||
| Neubauer counting chamber | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany | ||
| Objective | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica HC PL APO 10x/0.4 CS | |
| PBS | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | ph 7,4 sterile | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Percoll | Manufactured by our group with single components | 90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, ρ= 1,064 g cm-3 | |
| Percoll solution | GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Sweden | ||
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 10µL/100µL/200µL/1000µL | |
| Pipettes serological | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar2ml, 5ml, 10ml | |
| Pipetting heads | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Pipetus | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Polystyrol tube | Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Scissor | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Scale | Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Germany | ||
| Suction unit | Integra bioscience, Fernwald, Germany | Vacusafe comfort | |
| Surgical scissors | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Trypan blue solution 0,4 % | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Tubes with cap | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 15ml, 50ml Cellstar | |
| Xylazine (2 %) | Ceva Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf, Germany |
References
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