Intravital mikroskopi av monocyt Homing och tumör-relaterade angiogenes i en murin modell av perifer arteriell sjukdom
Summary
Monocyter är viktiga mediatorer av arteriogenesis i samband med perifer arteriell sjukdom. Detta protokoll använder en basalmembranet-liknande matris och intravital mikroskopi, och undersöker monocyt homing och tumör-relaterade angiogenes efter monocyt injektion i lårbensartären ligering murina modellen.
Abstract
Det terapeutiska målet för perifer arteriell sjukdom och ischemisk hjärtsjukdom är att öka blodflödet till ischemiska områden orsakas av hemodynamiska stenos. Kärlkirurgi är ett gångbart alternativ i utvalda fall, men för patienter utan indikationer för kirurgi såsom progression att vila smärta, kritiska lem ischemi eller stora störningar liv eller arbete, finns det några möjligheter för att mildra deras sjukdom. Cellterapi via monocyt-förbättrad genomblödning genom stimulering av säkerheter bildandet är en av några icke-invasiva alternativ.
Vår grupp undersöker arteriogenesis efter monocyt transplantation i möss med bakbenet ischemi modell. Tidigare har vi visat förbättring i bakbenet perfusion med stelkramp-stimulerad syngena monocyt transplantation. Förutom effekterna på säkerheter bildandet, kan tumörtillväxt påverkas av denna terapi också. För att undersöka dessa effekter, använder vi en basalmembranet-liknande matris musmodell genom att injicera den extracellular matrisen av den Engelbreth-Holm-Swarm sarkom i flanken av musen, efter ocklusion av femoralartären.
Efter de konstgjorda tumör studierna, vi använder intravital mikroskopi för att studera i vivo tumör-angiogenes och monocyt homing inom säkerheter artärer. Tidigare studier har beskrivit en Histologisk undersökning av djurmodeller, vilket förutsätter efterföljande analys till obduktion artefakter. Vår strategi visualiserar monocyt homing rättsområden collateralization i realtid sekvenser, är lätt att utföra, och undersöker processen för arteriogenesis och tumör angiogenes i vivo.
Introduction
Hjärt-kärlsjukdomar, inklusive kranskärlssjukdom eller perifer arteriell sjukdom, är de vanligaste orsakerna till dödsfall globalt1. Cellterapi är en lovande metod att behandla hjärt-kärlsjukdom, särskilt för människor som inte kan genomgå kirurgiska ingrepp. I området i närheten finns det flera metoder att använda celler eller deras utsöndras ämnen som ett terapeutiskt verktyg2,3, med det övergripande målet att förbättra perfusionen och upprätthålla funktion av ischemisk och underperfused vävnad. Ett försök att uppnå detta mål är att förbättra arteriogenesis, vilket stärker utvecklingen av säkerheter artärer. Monocyter är en viktig celltyp som är associerad med collateralization. Vår grupp har fokuserat på forska effekterna av monocyter i områden av inflammation4,5, i synnerhet med bakbenet ischemi modell för att inducera ischemi och efterföljande inflammation6. Monocyter hem till områdena av inflammation och orsaka komplexa systemiska reaktioner som leder till utveckling av collateralization7.
Med användning av intravital mikroskopi, kan vi studera beteendet hos dessa celler i vivo och observera homing av injicerade monocyter till områdena av inflammation. De flesta tidigare studier bara beskriva obduktion analyser, som hålla nackdelar inklusive en introduktion av histologiska artefakter och ett stort antal djur som krävs för preparat. Med vårt arbetssätt kan vi undersöka immunologiska processer och säkerheter bildning via live imaging vid flera tidpunkter.
Förutom utvecklingen av säkerheter artärer i ischemiska områden påverka monocyter också tumörens tillväxt. För att undersöka dessa processer, vi injicerar en basalmembranet-liknande matris utvinns ur Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom, en tumör som är rik på extracellulära matrix proteiner8, och analysera hjälp intravital mikroskopi. Denna matris används till provspelning molekyler för antingen endotelceller nätverk bildandet eller mot cancer terapier genom angiogena hämning; i detta fall kommer vi att bedöma tumör angiogena potential av monocyter för cell terapi9,10,11.
Syftet med detta protokoll är att demonstrera ett enkelt och effektivt sätt att studera immunologiska processer orsakas av ischemi i en in-vivo -modell. Vi kan skapa en mer realistisk testmiljö jämfört med histologiska workup av besiktning muskelvävnad.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den metod som beskrivs här belyser utvecklingen av säkerheter artärer, uppförandet av monocyter i dessa fartyg, och processen för arteriogenesis. Stegen för tillämpningen av detta protokoll är lätt att lära sig och kan användas inom andra områden av vetenskap. Trots dessa fördelar finns det några nackdelar. Exempelvis är mikroskopisk utrustning krävs för att köra teknikerna som beskrivs. Att skaffa utrustning för ett experiment är ohållbar, så det är viktigt att samarbeta med andra institutioner at…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av den ELSE-Kröner-Stiftung och den DFG (Deutsche Forschungsgemeinschafts, tyska Research Foundation) SFB 854 (Sonderforschungsbereich, collaborative research center). Speciellt tack till Hans-Holger Gärtner, Audiovisuelles Medienzentrum, Otto-von-Guericke University Magdeburg, Magdeburg, Tyskland, för teknisk support.
Materials
| 10% fetal calf serum (FCS) | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1% penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1mL Omnifix -F insuline syringe | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
| 50 ml syringe | Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Germany | Injectomat- syringe 50 ml with canule | |
| 6-well-ultra-low-attachement-plates | Corning Incorporated, NY, USA | ||
| 8- 12 week old, male, C57BL/6, BalbC mice | Charles River, Sulzfeld, Germany | ||
| Adhesive tape | TESA SE, Hamburg, Germany | ||
| Acquisition Software | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); Version: 2.7.3.9723 | |
| Canules | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 29G, 30G | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Cell culture medium | Manufactured by our group with single components | Medium199, 10% Fetal calf serum, 1% Antibiotic (penicillin/streptomycin) | |
| Centrifuge | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany | Allegra X-15R centrifuge | |
| Depilatory cream | Veet, Mannheim, Germany | ||
| DiO | Invitrogen Eugene, Oregon, USA | ||
| Disinfection agent | Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany | ||
| Disposable scalpel No.10 | Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan | ||
| EDTA | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Erlenmeyer flask | GVB, Herzogenrath, Germany | ||
| Ethanol 70% | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany | ||
| Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Fine Forceps | Rubis, Stabio, Switzerland | ||
| Flurophor/Rhodamindextran | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA | Katalognummer: D-1819 | |
| Gloves | Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany | ||
| Heating pad | Labotect GmbH, Göttingen, Germany | Hot Plate 062 | |
| Human macrophage-colony stimulating factor | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | SRP3110 | |
| Humane leucocyte filters | Blood preservation | ||
| Incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | ||
| Isoflurane | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
| Ketamine (10%) | Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin , Germany | ||
| Leukocyte separation tubes (tubes with filter) | Bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Light microscope | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany | Axiovert 40 C | |
| Lymphocyte separation medium LSM1077 | GE Healthcare, Pasching, Austria | ||
| Matrigel | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | ||
| Medium M199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria | ||
| Microbiological work bench | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany | Hera safe | |
| Microscope slide | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | Art. Nr. 1879 | |
| Microscope stand with incubator and heating unit | Leica DMI 6000, Pecon, Germany | ||
| Monocyte wash buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA | |
| Mouse restrainer | Various | ||
| Multi-photon microscope | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica SP5 Confocal microscope, Cameleon, Coherent | |
| NaCl (0,9%) | Berlin Chemie AG, Berlin, Germany | ||
| Neubauer counting chamber | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany | ||
| Objective | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica HC PL APO 10x/0.4 CS | |
| PBS | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | ph 7,4 sterile | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Percoll | Manufactured by our group with single components | 90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, ρ= 1,064 g cm-3 | |
| Percoll solution | GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Sweden | ||
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 10µL/100µL/200µL/1000µL | |
| Pipettes serological | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar2ml, 5ml, 10ml | |
| Pipetting heads | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Pipetus | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Polystyrol tube | Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Scissor | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Scale | Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Germany | ||
| Suction unit | Integra bioscience, Fernwald, Germany | Vacusafe comfort | |
| Surgical scissors | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Trypan blue solution 0,4 % | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Tubes with cap | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 15ml, 50ml Cellstar | |
| Xylazine (2 %) | Ceva Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf, Germany |
References
- Volz, K. S., Miljan, E., Khoo, A., Cooke, J. P. Development of pluripotent stem cells for vascular therapy. Vascular pharmacology. 56 (5-6), 288-296 (2012).
- Henry, T. D., et al. The VIVA trial: Vascular endothelial growth factor in Ischemia for Vascular Angiogenesis. Circulation. 107 (10), 1359-1365 (2003).
- Wagner, M., et al. Isolation and intravenous injection of murine bone marrow derived monocytes. Journal of visualized experiments JoVE. (94), (2014).
- Herold, J., et al. Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth. Human gene therapy. 15 (1), 1-12 (2004).
- Ito, W. D., Arras, M., Scholz, D., Winkler, B., Htun, P., Schaper, W. Angiogenesis but not collateral growth is associated with ischemia after femoral artery occlusion. The American journal of physiology. 273 (3 Pt 2), H1255-H1265 (1997).
- Herold, J., et al. Tetanus toxoid-pulsed monocyte vaccination for augmentation of collateral vessel growth. Journal of the American Heart Association. 3 (2), e000611 (2014).
- . Matrigel Matrix Available from: https://www.corning.com/au/en/products/life-sciences/products/surfaces/matrigel-matrix.html (2017)
- Eubank, T. D., Galloway, M., Montague, C. M., Waldman, W. J., Marsh, C. B. M-CSF induces vascular endothelial growth factor production and angiogenic activity from human monocytes. Journal of immunology (Baltimore, Md. 1950). 171 (5), 2637-2643 (2003).
- Fridman, R., et al. Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel. Journal of the National Cancer Institute. 83 (11), 769-774 (1991).
- Woodman, S. E., et al. Caveolin-1 knockout mice show an impaired angiogenic response to exogenous stimuli. The American journal of pathology. 162 (6), 2059-2068 (2003).
- Francke, A., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. Transplantation of bone marrow derived monocytes: a novel approach for augmentation of arteriogenesis in a murine model of femoral artery ligation. American journal of translational research. 5 (2), 155-169 (2013).
- Houthuys, E., Movahedi, K., Baetselier, P., de Van Ginderachter, J. o. A., Brouckaert, P. A method for the isolation and purification of mouse peripheral blood monocytes. J. Immunol. Methods. 359 (1-2), 1-10 (2010).
- Berthold, F. Isolation of human monocytes by Ficoll density gradient centrifugation. Blut. 43 (6), 367-371 (1981).
