Intravitalen Mikroskopie Monocyte Homing und Tumor-bezogene Angiogenese in einem Mausmodell der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit
Summary
Monozyten sind wichtige Vermittler des Arteriogenesis im Rahmen der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit. Mit einem Basalmembran-wie Matrix und intravitalen Mikroskopie, untersucht dieses Protokoll Monocyte homing und im Zusammenhang mit Tumor-Angiogenese nach Monocyte-Injektion in die Femoral Arterie Ligatur Mausmodell.
Abstract
Das therapeutische Ziel für periphere arterielle Verschlusskrankheit und ischämischen Herzkrankheiten soll Blutfluss auf ischämische Bereiche durch hämodynamische Stenose verursacht zu erhöhen. Gefäßchirurgie ist ein gangbarer Weg in ausgewählten Fällen, sondern für Patienten ohne Indikation für eine Operation wie Fortschreiten zum Ausruhen, Schmerzen, kritische Extremität Ischämie oder größeren Störungen zum Leben oder arbeiten, gibt es nur wenige Möglichkeiten zur Linderung ihrer Krankheit. Zelltherapie über Monocyte-verbesserte Durchblutung durch die Stimulierung der Sicherheiten Bildung ist eine der wenigen nicht-invasive Optionen.
Unsere Gruppe untersucht Arteriogenesis nach der Monocyte Transplantation in Mäuse mit dem Megalosauridae Ischämie-Modell. Wir haben zuvor, Verbesserung der Megalosauridae Perfusion mit Tetanus-stimulierten Phänomen Monocyte Transplantation gezeigt. Neben den Effekten auf die Sicherheiten Bildung könnte diese Therapie sowie Tumorwachstum betroffen sein. Um diese Effekte zu untersuchen, verwenden wir eine Basalmembran-wie Matrix-Maus-Modell durch die Injektion der extrazellulären Matrix von Engelbreth-Holm-Schwarm-Sarkom in der Flanke der Maus, nach Okklusion der Femoral Arterie.
Nach dem Studium der künstlichen Tumor wir verwenden intravitalen Mikroskopie in Vivo Tumor-Angiogenese und Monocyte homing in Sicherheiten Arterien zu studieren. Frühere Studien haben die histologische Untersuchung von Tiermodellen, beschrieben die anschließende Analyse zu Post-Mortem- Artefakten voraussetzt. Unser Ansatz Monocyte Homing auf Bereiche der Besicherung in Echtzeit Sequenzen visualisiert, ist einfach durchzuführen, und den Prozess der Arteriogenesis und Tumor Angiogenesis in Vivountersucht.
Introduction
Herz-Kreislauf-Krankheiten, einschließlich koronarer Herzkrankheit oder periphere arterielle Verschlusskrankheit, sind die häufigsten Todesursachen weltweit1. Zelltherapie ist ein vielversprechender Ansatz zur Behandlung von Herz-und Kreislauferkrankungen, insbesondere für Menschen, die nicht in der Lage, chirurgische Eingriffe zu unterziehen sind. Es gibt mehrere Ansätze, Zellen oder ihre sekretierten Stoffe als therapeutisches Werkzeug2,3, mit dem übergeordneten Ziel, verbessern die Durchblutung und Funktion des ischämischen und underperfused Gewebe zu verwenden. Ein Versuch, dieses Ziel zu erreichen ist, Arteriogenesis, zu verbessern, die die Entwicklung von Sicherheiten Arterien erhöht. Monozyten sind ein wichtiger Zelltyp Besicherung zugeordnet. Unsere Gruppe konzentrierte sich auf die Erforschung der Wirkung von Monozyten in Bereichen der Entzündung4,5, insbesondere mit dem Megalosauridae Ischämie Modell induzieren Ischämie und anschließende Entzündung6. Monozyten nach Hause zu Bereichen der Entzündung und führen komplexe systemische Reaktionen, die zur Entwicklung der Besicherung7führen.
Mit dem Einsatz der intravitalen Mikroskopie wir untersuchen das Verhalten von diesen Zellen in Vivo und der Homing von injizierten Monozyten zu Bereichen der Entzündung zu beobachten. Die meisten frühere Studien beschreiben nur post-mortem Analysen, die Nachteile einschließlich einer Einführung der histologische Artefakte und eine große Zahl des Tieres für Vorbereitungen erforderlich halten. Mit unserem Ansatz können wir untersuchen, immunologische Prozesse und Sicherheiten Bildung über live imaging zu mehreren Zeitpunkten.
Neben der Entwicklung von Sicherheiten Arterien in ischämische Bereiche beeinflussen Monozyten auch Tumorwachstum. Um diese Prozesse zu untersuchen, wir Spritzen eine Basalmembran-ähnliche Matrix aus Engelbreth-Holm-Schwarm Maus Sarkom, ein Tumor reiche extrazelluläre Matrix Proteine8, extrahiert und analysieren mit intravitalen Mikroskopie. Diese Matrix wird für Endothelzellen Netzwerkbildung oder Anti-Krebs-Therapien durch Hemmung der Angiogenese zu Probeaufnahmen Moleküle verwendet; in diesem Fall werden wir das Tumor angiogenen Potenzial von Monozyten für Zelle Therapie9,10,11bewerten.
Dieses Protokoll soll eine einfache und effiziente Möglichkeit, immunologische Prozesse verursacht durch Ischämie in einem in Vivo Modell zu studieren nachgewiesen werden. Wir erzeugen eine realistische Testumgebung im Vergleich zur histologischen Aufarbeitung von post-mortem Muskelgewebe.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebene Methode wirft Licht auf die Entwicklung von Sicherheiten Arterien, das Verhalten von Monozyten in diesen Gefäßen und den Prozess der Arteriogenesis. Die Schritte für die Anwendung dieses Protokolls sind leicht zu erlernen und kann verwendet werden, in anderen Bereichen der Wissenschaft. Trotz dieser Vorteile gibt es einige Nachteile. Zum Beispiel ist mikroskopische Ausrüstung erforderlich, um die beschriebenen Techniken ausführen. Beschaffung von Ausrüstung für ein Experiment ist unhaltbar, s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der ELSE-Kröner-Stiftung unterstützt und die DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG) SFB 854 (Sonderforschungsbereich, Sonderforschungsbereich). Besonderen Dank an Hans-Holger Gärtner, Audiovisuelles Medienzentrum, Otto-von-Guericke Universität Magdeburg, Magdeburg, Deutschland, für den technischen Support.
Materials
| 10% fetal calf serum (FCS) | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1% penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| 1mL Omnifix -F insuline syringe | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | ||
| 50 ml syringe | Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Germany | Injectomat- syringe 50 ml with canule | |
| 6-well-ultra-low-attachement-plates | Corning Incorporated, NY, USA | ||
| 8- 12 week old, male, C57BL/6, BalbC mice | Charles River, Sulzfeld, Germany | ||
| Adhesive tape | TESA SE, Hamburg, Germany | ||
| Acquisition Software | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); Version: 2.7.3.9723 | |
| Canules | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 29G, 30G | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Cell culture medium | Manufactured by our group with single components | Medium199, 10% Fetal calf serum, 1% Antibiotic (penicillin/streptomycin) | |
| Centrifuge | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany | Allegra X-15R centrifuge | |
| Depilatory cream | Veet, Mannheim, Germany | ||
| DiO | Invitrogen Eugene, Oregon, USA | ||
| Disinfection agent | Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany | ||
| Disposable scalpel No.10 | Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan | ||
| EDTA | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Erlenmeyer flask | GVB, Herzogenrath, Germany | ||
| Ethanol 70% | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany | ||
| Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Fine Forceps | Rubis, Stabio, Switzerland | ||
| Flurophor/Rhodamindextran | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA | Katalognummer: D-1819 | |
| Gloves | Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany | ||
| Heating pad | Labotect GmbH, Göttingen, Germany | Hot Plate 062 | |
| Human macrophage-colony stimulating factor | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | SRP3110 | |
| Humane leucocyte filters | Blood preservation | ||
| Incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | ||
| Isoflurane | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
| Ketamine (10%) | Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin , Germany | ||
| Leukocyte separation tubes (tubes with filter) | Bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Light microscope | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany | Axiovert 40 C | |
| Lymphocyte separation medium LSM1077 | GE Healthcare, Pasching, Austria | ||
| Matrigel | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | ||
| Medium M199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria | ||
| Microbiological work bench | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany | Hera safe | |
| Microscope slide | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe | Art. Nr. 1879 | |
| Microscope stand with incubator and heating unit | Leica DMI 6000, Pecon, Germany | ||
| Monocyte wash buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA | |
| Mouse restrainer | Various | ||
| Multi-photon microscope | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica SP5 Confocal microscope, Cameleon, Coherent | |
| NaCl (0,9%) | Berlin Chemie AG, Berlin, Germany | ||
| Neubauer counting chamber | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany | ||
| Objective | Leica, Wetzlar, Deutschland | Leica HC PL APO 10x/0.4 CS | |
| PBS | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | ph 7,4 sterile | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Percoll | Manufactured by our group with single components | 90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, ρ= 1,064 g cm-3 | |
| Percoll solution | GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Sweden | ||
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 10µL/100µL/200µL/1000µL | |
| Pipettes serological | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar2ml, 5ml, 10ml | |
| Pipetting heads | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Pipetus | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Polystyrol tube | Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Scissor | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Scale | Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Germany | ||
| Suction unit | Integra bioscience, Fernwald, Germany | Vacusafe comfort | |
| Surgical scissors | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Trypan blue solution 0,4 % | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Tubes with cap | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 15ml, 50ml Cellstar | |
| Xylazine (2 %) | Ceva Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf, Germany |
References
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