Ciblage des Thiols de cystéine pour in Vitro in situ Glycosylation des protéines recombinantes

Résumé

Des analyses biochimiques et structurales des protéines glycosylées exigent des quantités relativement importantes des échantillons homogènes. Nous présentons ici une méthode chimique efficace pour in site glycosylation des protéines recombinantes purifiée à partir de bactéries en ciblant les réactifs Cys thiols.

Résumé

Stromale interaction molécule-1 (STIM1) est un type-j’ai une protéine transmembranaire située sur le réticulum endoplasmique (re) et la membrane plasmique (PM). STIM1 ER-résident réglemente l’activité des canaux PM Orai1 dans un processus connu comme stocker entrée de commande de calcium (Ca^{2 +}) qui est le principal Ca^{2 +} signalisation processus qui entraîne la réponse immunitaire. STIM1 subit post-traductionnelles N- glycosylation sur deux sites de crash luminales au sein du Ca^{2 +} détection domaine de la molécule. Toutefois, la biochimiques, biophysiques, et effets biologiques structure des N- glycosylées STIM1 ont été mal compris jusqu'à ce que récemment en raison de l’incapacité d’obtenir facilement des niveaux élevés de homogène N- glycosylées protéine. Nous décrivons ici la mise en œuvre d’une approche in vitro chimique qui s’attache à moitiés de glucose aux sites de protéine spécifique applicables à la compréhension des effets sous-jacents de N- glycosylation sur le mécanisme et la structure des protéines. En utilisant la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire de solution, nous évaluons les deux l’efficacité de la modification, ainsi que les conséquences structurelles de l’attachement de glucose avec un seul échantillon. Cette approche peut facilement être adaptée pour étudier les protéines glycosylées myriad trouvées dans la nature.

Introduction

Stocker les exploités de calcium (Ca^{2 +}) entrée (SOCE) est la principale voie par laquelle les cellules immunitaires prennent Ca^{2 +} de l’espace extracellulaire dans le cytosol. Dans les lymphocytes T, lymphocytes T récepteurs situés sur la membrane plasmique (PM) lient antigènes qui activent la protéine-tyrosine kinases (évaluées à ^1,2,3). Une cascade de phosphorylation entraîne l’activation de la phospholipase-γ (PLCγ) qui intervient par la suite dans l’hydrolyse de la membrane phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP₂) en diacylglycérol e....

Protocole

1. réaction en chaîne par polymérase (PCR)-médiée par mutagénèse dirigée pour l’incorporation de Cys dans un vecteur d’expression bactérienne pET-28 a.

1. Déterminer la concentration du vecteur animal-28 a (c'est-à-dire ADN bicaténaire) en utilisant un coefficient d’extinction ultraviolet (UV) de 0,020 (μg/mL) cm ^-1 à 260 nm.
2. Synthétiser une paire d’amorces mutagéniques complémentaires pour chaque mutation Cys telle j’ai) il y a un minimum de 15 nucléotides complémentaires pour le modèle avant l’incompatibilité de la première base et 15 nucléotides complémentaires pour le modèle après le incompatibilité de base finale, ii....

Résultats

La première étape de cette approche nécessite la mutagénèse des résidus de glycosylation candidat aux résidus Cys qui peuvent être modifiables à l’aide de la EFSAM de glucose-5-MTS. n’a aucun résidu Cys endogènes, donc aucune des considérations particulières ne doivent être apportées avant la mutagenèse. Toutefois, les résidus Cys natives doivent être mutés aux résidus non modifiable avant d’effectuer la chimie décrite. Pour au minimum réaliser la structure native, nous vous suggérons d’e.......

Discussion

Glycosylation des protéines est une modification post-traductionnelle où les sucres sont covalente aux polypeptides principalement par le biais de liens avec des chaînes latérales d’acides aminés. Jusqu'à 50 % de protéines de mammifères sont glycosylés ⁵⁴, où les protéines glycosylées peuvent avoir par la suite une gamme variée d’effets de dérégler l’affinité de liaison biomoléculaire, influençant la protéine pliage, altérant l’activité du canal, ciblage molécules de dégradation et cellulaires tra.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Phusion ADN polymérase	Thermo Fisher Scientific	F530S	À utiliser à l’étape 1.3.
Generuler 1kb Échelle d’ADN	Thermo Fisher Scientific	FERSM1163	Utiliser à l’étape 1.6.
Enzyme de restriction DpnI	New England Biolabs, Inc.	R0176	À utiliser à l’étape 1.8.
Mini kit plasmidique Presto	GeneAid, Inc.	PDH300	À utiliser à l’étape 1.16.
BL21 DE3 codon (+) E. coli	Agilent Technologies, Inc.	230280	À utiliser à l’étape 2.1.
DH5a E. coli	Invitrogen, Inc.	18265017	À utiliser à l’étape 1.9.
Filtre à seringue de 0,22 mm	Millipore, Inc.	SLGV033RS	À utiliser à l’étape 2.3.
HisPur Ni2+-NTA Résine d’agarose	Thermo Fisher Scientific	88221	À utiliser à l’étape 3.3.
3 500 Da MWCO Tube de dialyse	BioDesign, Inc.	D306	À utiliser aux étapes 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 et 4.6.
Thrombine bovine	BioPharm Laboratories, Inc.	SKU91-055	À utiliser à l’étape 3.9.
5 mL HiTrap Q FF Colonne d’échange d’anions	GE Healthcare, Inc.	17-5156-01	À utiliser à l’étape 3.11.
Glucose-5-MTS	Toronto Research Chemicals, Inc.	G441000	À utiliser à l’étape 4.1.
Concentrateurs centrifuges d’ultrafiltration Vivaspin 20	Sartorius, Inc.	VS2001	À utiliser aux étapes 3.11, 4.2, 4.5 et 4.6.
PageRuler Unstained Broad Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific	26630	À utiliser aux étapes 3.7, 3.10 et 3.15
HiTrap Q FF Anion Exchange Column	GE Healthcare, Inc.	17-5053-01	À utiliser à l’étape 3.12.
Système de chromatrographie liquide à protéines rapides AKTA	GE Healthcare, Inc.	29018224	À utiliser à l’étape 3.14.
Spectromètre RMN Varian Inova 600 MHz	Agilent Technologies, Inc.		À utiliser aux étapes 5.2 et 5.5.