שיקולים מעשיים בלימוד כיבוש ריאות גרורתי אוסטאוסרקומה באמצעות וזמינותו גרורות בריאות
Summary
מטרת מאמר זה היא לספק תיאור מפורט של הפרוטוקול וזמינותו גרורות בריאות (פומה). מודל זה מאפשר לחוקרים ללמוד אוסטאוסרקומה גרורתי (OS) גידול תאים של רקמת הריאה באמצעות קרינה פלואורסצנטית widefield או מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר.
Abstract
גרורות בריאות וזמינותו (פומה) הוא שמחוץ ריאות explant מערכת התרבות תאים סגורים שמקנה לחוקרים ללמוד את הביולוגיה של כיבוש ריאות אוסטאוסרקומה (OS) על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. מאמר זה מספק תיאור מפורט של הפרוטוקול ודן דוגמאות של קבלת נתוני תמונה על גידול גרורתי באמצעות widefield או פלטפורמות מיקרוסקופ קונפוקלי זריחה. הגמישות של המודל פומה שמקנה לחוקרים ללמוד לא רק את הצמיחה של תאים OS microenvironment הריאה, אלא גם כדי להעריך את ההשפעות של הרפוי אנטי גרורתי לאורך זמן. מיקרוסקופיה קונפוקלית מאפשר הדמיה חסרת תקדים, ברזולוציה גבוהה של מערכת ההפעלה תא אינטראקציות עם parenchyma הריאה. יתר על כן, כאשר המודל פומה משולב עם צבעי פלורסנט או כתבים גנטי חלבון פלואורסצנטי, חוקרים יכולים ללמוד את microenvironment הריאה, מבנים הסלולר subcellular, תפקוד הגן, יזם פעילות בתאים OS גרורתי. המודל פומה מספק כלי חדש עבור אוסטאוסרקומה חוקרים לגלות ביולוגיה גרורות חדשות, להעריך את הפעילות של טיפולים אנטי גרורתי, ממוקד.
Introduction
תוצאות משופרות עבור ילדים חולים עם גרורות אוסטאוסרקומה (OS) נשאר עדיין צורך קליני קריטי 1. זה מדגיש את החשיבות של לפתח טיפולים חדשים ממוקדות מולקולרי. Chemotherapeutics המקובלת כי התפשטות תאים סרטניים היעד לא הוכיחו להיות יעיל בטיפול במחלה גרורתית, ובכך אסטרטגיות הרומן חייב לכוון תהליך גרורתי עצמו 2. המאמר הנוכחי דן בהיבטים של סוג חדש יחסית של ex-vivo מודל ריאות גרורות, וזמינותו גרורות בריאות (פומה) שפותחה על ידי מנדוזה ועמיתיו3, אשר מספק כלי שימושי גילוי חדש מנהלי התקנים מולקולריים בהתקדמות גרורות ריאה OS 4,5. לפני שתמשיך, עם זאת, יהיה נבון. לגעת בקצרה על מספר המודלים הנוכחיים של גרורות, מבחני איך המודל פומה מציעה מספר יתרונות על-קונבנציונאלי במבחנה .
ביותר ניסיוניות המשמשות ללימוד גרורות המרכיבים של מערכות במבחנה , ויוו מסכם את הדברים צעד מסוים או מספר שלבים של המפל גרורתי. השלבים הבאים כוללים: תאים סרטניים 1) מעביר הגידול העיקרי, 2) intravasation לתוך כלי הסמוך (הדם או הלימפה), המעבר בתוך מחזור הדם, 3) לעצור באתר משני, 4) extravasation ו הישרדות באתר משני, היווצרות 5) של micrometastases, ו- 6) הצמיחה לתוך vascularized גרורות (איור 1). במבחנה מודלים של גרורות ניתן לכלול העברה (2D) 2-ממדי, תלת-ממדי (3D) Matrigel הפלישה מבחני אשר נבדקות ב פירוט במקום 6. עבור מודלים ויוו , לכלול שתי המערכות מודל נפוץ: 1) דגם גרורות ספונטני הוא איפה תאים סרטניים orthotopically מוזרק לתוך סוג רקמות ספציפיות כדי בצורת גידול מקומי אשר באופן ספונטני משיל תאים גרורתי לאתרים מרוחקים; 2) דגם ניסיוני גרורות הוא שבו תאים סרטניים מוזרקים לתוך כלי הדם במעלה הזרם של האיבר היעד. לדוגמה, זנב הווריד הזרקה של תאי הגידול בתוצאות פיתוח ריאות גרורות5,7,8. דגמים אחרים גרורה ניסיוני כוללים הזרקה של תאים סרטניים לתוך הטחול או וריד מצע המעי העליון אשר גורמת להתפתחות גרורות בכבד9,10. שיקולים מעשיים של מודלים אלה ויוו נדונים בפירוט על ידי ולש 11. עוד ויוו דגם המשמשות ללימוד גרורות ב סרקומות של ילדים הוא המודל השרשה הגידול subcapsular כליה כליות שתוצאתה היווצרות הגידול המקומי, גרורות ספונטנית הריאות 12,13. טכניקה יותר מבחינה טכנית תובעניים כגון intravital videomicroscopy יכול ישירות להמחיש, בזמן אמת, אינטראקציות בין תאי סרטן גרורתי של microvasculature של אתר גרורתי (כלומר. הריאות או הכבד) כפי שתואר על ידי מקדונלד14 Entenberg15, או סרטן extravasation תא ממברנה chorioallantoic כפי שמתואר על ידי קים 16.
המודל הפומה הוא ex-vivo, explant רקמת הריאה, מערכת תרבות סגורה איפה הצמיחה של תאים סרטניים פלורסנט יכול להיות longitudinally שנצפו באמצעות מיקרוסקופ זריחה על פני תקופה של חודש (ראה איור 2 א). מודל זה recapitulates בשלבים הראשונים של הריאה קולוניזציה (שלבים 3 עד 5) בהמפל גרורתי. הם כמה מהיתרונות העיקריים של המודל פומה על-קונבנציונאלי במבחנה מודלים: 1) היא מספקת הזדמנות למדוד longitudinally צמיחת תאים של סרטן גרורתי ב- microenvironment תלת-ממד זה שומר על תכונות רבות של הריאות microenvironment ב ויוו 3; 2) פומה מאפשר החוקר להעריך נוקאאוט של טיפול גנטי או סמים למועמד יש פעילות אנטי-גרורתי בהקשר של microenvironment הריאה תלת-ממד; 3) המודל הפומה הוא גמיש עם סוגים רבים של קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ פלטפורמות (איור 2B) כגון widefield קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ או סריקה בלייזר קונפוקלית, דוגמאות של כל אחד מוצגים באיור 2C & D, בהתאמה. במאמר זה נדון כיצד להשתמש במודל של פומה כדי לקבל נתונים הדמיה האורך על גידול גרורתי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (eGFP) משופרת-המבטאת תאי האדם אוסטאוסרקומה גרורתי גבוה ונמוך (MNNG וזונות תאים, בהתאמה) באמצעות קרינה פלואורסצנטית ההגדלה נמוך widefield. דוגמאות של הדמיה של הפלורסנט אשר תוויות parenchyma הריאה, חלבון אדום-פלורסנט כתב גנטי, אשר מתייג המיטוכונדריה ב OS תאים במודל פומה באמצעות סריקה בלייזר מיקרוסקופיה קונפוקלית נדונות גם.
Protocol
Representative Results
Discussion
להלן מאמר טכני המתאר כמה היבטים מעשיים של המודל פומה בלימוד קולוניזציה ריאות ב- OS. כמה צעדים קריטיים בפרוטוקול איפה החוקרים צריכים להיזהר במיוחד כוללות את הפעולות הבאות:
a) תעלות של חוליות הצוואר. יכול להיפגע בקלות אל קנה הנשימה תוך כדי לנתח את השרירים שמסביב ואת רקמת חיבור. ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות ד ר Arnulfo מנדוזה שסיפק הכשרה בטכניקה פומה. בנוסף, ברצוננו להודות ד”ר צ’אנד Khanna, סוזן גארפילד (NCI/NIH), ואפריצ’יו סאם (סוכנות סרטן לפנה ס) על מתן השימוש שלהם מיקרוסקופים במהלך מחקר זה. מחקר זה נתמך (באופן חלקי) על-ידי התוכנית מחקר מגזר של מכוני הבריאות הלאומיים, במרכז לחקר הסרטן, סניף אונקולוגיה ילדים. M.M.L. נתמך על ידי מוסדות של בריאות מגזר ביקור עמית התכנית הלאומית (זוכה פרס 15335), כיום נתמכת על ידי מלגת פרקר ג’ואן בחקר גרורות. P.H.S. נתמך על ידי קרן סרטן קולומביה הבריטית.
Materials
| Table 2 | |||
| Cell culture reagents for A-media, B-media, and complete media | |||
| MNNG-HOS | ATCC | CRL-1547 | highly metastatic OS cell line |
| HOS | ATCC | CRL-1543 | poorly metastatic OS cell line |
| MG63.3 | Amy LeBlanc Laboratory (NCI) | N/A | highly metastatic OS cell line |
| MG63 | ATCC | CRL-1427 | poorly metastatic OS cell line |
| 10X M199 media | Thermofisher | 11825015 | Base media for A-media and B-media |
| Distilled Water (sterilized) | Thermofisher | 15230-147 | Component of A-media & B-media |
| 7.5% sodium bicarbonate solution | Thermofisher | 25080094 | Component of A-media & B-media |
| Hydrocortizone | Sigma-Alrich | H6909 | Component of A-media & B-media |
| Retinol acetate-water soluable | Sigma-Alrich | R0635-5MG | Component of A-media & B-media |
| Penicillin/Streptomycin 10X concentrated (10000 U/ml) solution | Thermofisher | 15140122 | Component of A-media & B-media, complete media. |
| Bovine insulin solution (10mg/ml) | Sigma-Alrich | I0516-5ML | Component of A-media & B-media |
| DMEM, high glucose | Thermofisher | 11965092 | Base media of Complete Media |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher | 25030081 | Component of Complete Media |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher | 16000044 | Component of Complete Media |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Thermofisher | 14190144 | Used in cell culture. |
| Hank’s Buffered Salts Solution, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermofisher | 14175095 | Used to resuspend cell pellet prior to injection |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermofisher | 25200114 | Used in cell culture. |
| DAR4M | Enzo | ALX-620-069-M001 | Used to label lung parenchyma. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 3 | |||
| Materials for PuMA | |||
| Zeiss 710 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Upright LSM confocal microscope |
| Zeiss 780 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Inverted LSM confocal microscope |
| SCID mice | Charles River | N/A | NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, female, age 6-8 weeks |
| GelFoam | Harvard Apparatus | 59-9863 | Used as a support for lung tissue sections. |
| SeaPlaque Agarose | Lonza | 50100 | Used during insufflation of the lung. |
| 1 ml syringe with 27 gauge needle | Fisherscientific | 14-826-87 | Used for tail vein injection. |
| 10 ml syringe | BD | 309604 | Used for insufflation of the lung. |
| 20 gauge catheter | Terumo | SR-OX2032CA | Used during insufflation of the lung. |
| Abbott IV extension set (30", Sterile) | Medisca | 8342 | Used during insufflation of the lung. |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | For wiping tail vein before injection |
| Sterile surgical gloves | Fisherscientific | Varies with size | Asceptic handing of mouse lungs |
| 30 cm ruler | Staples | Used for insufflation of the lung. | |
| Support stand for ruler | Pipette.com | HS29022A | Used for insufflation of the lung. |
| 35 mm glass-bottomed culture dish | Ibidi | 81158 | Used during imaging of lung slices |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | Used to line the sterile work area in the biological hood. |
| Catgut Plain Absorbable Suture | Braun | N/A | Used to tie off cannulated trachea. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 4 | |||
| Surgical instruments for PuMA | |||
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-5910 | For cutting lung sections |
| 4” (10 cm) Long Serrated Straight Extra Delicate 0.5mm Tip | Roboz | RS-5132 | For manipulating/holding lung sections. |
| 4” (10 cm) Long Serrated Slight Curve 0.8mm Tip | Roboz | RS5135 | For manipulating/holding lung sections. |
| Thumb Dressing Forceps; Serrated; Delicate; 4.5" Length; 1.3 mm Tip Width | Roboz | RS-8120 | For general dissection. |
| Thumb Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz | RS-8100 | For general dissection. |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp, 20mm blade | Roboz | RS-5880 | For general dissection. |
| Knapp Scissors; Straight; Sharp-Blunt; 27mm Blade Length; 4" Overall Length | Roboz | RS-5960 | For general dissection. |
References
- Khanna, C., et al. Toward a drug development path that targets metastatic progression in osteosarcoma. Clin Cancer Res. 20 (16), 4200-4209 (2014).
- Steeg, P. S. Perspective: The right trials. Nature. 485 (7400), S58-S59 (2012).
- Mendoza, A., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
- Hong, S. H., Ren, L., Mendoza, A., Eleswarapu, A., Khanna, C. Apoptosis resistance and PKC signaling: distinguishing features of high and low metastatic cells. Neoplasia. 14 (3), 249-258 (2012).
- Lizardo, M. M., et al. Upregulation of Glucose-Regulated Protein 78 in Metastatic Cancer Cells Is Necessary for Lung Metastasis Progression. Neoplasia. 18 (11), 699-710 (2016).
- Pouliot, N., Pearson, H. B., Burrows, A. Investigating Metastasis Using In Vitro Platforms. Metastatic Cancer: Clinical and Biological Perspectives. , (2012).
- Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).
- Morrow, J. J., et al. mTOR inhibition mitigates enhanced mRNA translation associated with the metastatic phenotype of osteosarcoma cells in vivo. Clinical Cancer Research. , (2016).
- Varghese, H. J., et al. In vivo videomicroscopy reveals differential effects of the vascular-targeting agent ZD6126 and the anti-angiogenic agent ZD6474 on vascular function in a liver metastasis model. Angiogenesis. 7 (2), 157-164 (2004).
- Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
- Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clin Exp Metastasis. 15 (3), 272-306 (1997).
- Somasekharan, S. P., et al. YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1. J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).
- El-Naggar, A. M., et al. Translational Activation of HIF1alpha by YB-1 Promotes Sarcoma Metastasis. Cancer Cell. 27 (5), 682-697 (2015).
- MacDonald, I. C., Groom, A. C., Chambers, A. F. Cancer spread and micrometastasis development: quantitative approaches for in vivo models. Bioessays. 24 (10), 885-893 (2002).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nat Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Kim, Y., et al. Quantification of cancer cell extravasation in vivo. Nat Protoc. 11 (5), 937-948 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Underwood, E. E. . Quantitative stereology. , (1970).
- Tanaka, K., et al. In vivo optical imaging of cancer metastasis using multiphoton microscopy: a short review. Am J Transl Res. 6 (3), 179-187 (2014).
- Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research. Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).
- Bijgaart, R. J., Kong, N., Maynard, C., Plaks, V. Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment. J Vis Exp. (108), e53741 (2016).
- Guha, M., et al. Mitochondrial retrograde signaling induces epithelial-mesenchymal transition and generates breast cancer stem cells. Oncogene. 33 (45), 5238-5250 (2014).
- Ren, L., Morrow, J. J., et al. Positively selected enhancer elements endow osteosarcoma cells with metastatic competence. . Nat Med. , (2018).
- Ren, L., et al. Metabolomics uncovers a link between inositol metabolism and osteosarcoma metastasis. Oncotarget. 8 (24), 38541-38553 (2017).
- Ren, L., et al. Characterization of the metastatic phenotype of a panel of established osteosarcoma cells. Oncotarget. 6 (30), 29469-29481 (2015).
