Considerazioni pratiche nello studio di colonizzazione del polmone metastatico nell'Osteosarcoma usando l'analisi di metastasi polmonare
Summary
L’obiettivo di questo articolo è di fornire una descrizione dettagliata del protocollo per il dosaggio di metastasi polmonare (PuMA). Questo modello permette ai ricercatori di studiare la crescita delle cellule di osteosarcoma metastatico (OS) nel tessuto del polmone usando un widefield fluorescenza o il microscopio confocale a scansione laser.
Abstract
Il dosaggio di metastasi polmonare (PuMA) è un ex vivo espianto del polmone e il sistema di coltura di cellule chiuse che permette ai ricercatori di studiare la biologia della colonizzazione del polmone nell’osteosarcoma (OS) da microscopia di fluorescenza. In questo articolo fornisce una descrizione dettagliata del protocollo e vengono illustrati esempi di ottenere dati di immagine sulla crescita metastatica utilizzando widefield o piattaforme di microscopia di fluorescenza confocale. La flessibilità del modello PuMA permette i ricercatori a studiare non solo la crescita delle cellule di OS nel microambiente polmonare, ma anche di valutare gli effetti di anti-metastatica terapeutica nel tempo. La microscopia confocale permette per l’imaging ad alta risoluzione, senza precedenti delle interazioni cellula OS con il parenchima polmonare. Inoltre, quando il modello di PuMA è combinato con coloranti fluorescenti o reporter genetici proteina fluorescente, i ricercatori possono studiare il microambiente polmonare, strutture cellulare e subcellulare, funzione del gene e l’attività del promotore in cellule metastatiche di OS. Il modello PuMA fornisce un nuovo strumento per i ricercatori di osteosarcoma scoprire la nuova biologia di metastasi e valutare l’attività di nuove terapie anti-metastatiche, mirate.
Introduction
I risultati migliori per i pazienti pediatrici con osteosarcoma metastatico (OS) rimane ancora un bisogno insoddisfatto critico di clinica 1. Ciò sottolinea l’importanza di sviluppare nuove terapie mirate al livello molecolare. Chemioterapici convenzionali che proliferazione delle cellule tumorali di destinazione non hanno dimostrato di essere efficace nel trattamento della malattia metastatica e quindi nuove strategie devono avere come destinazione lo stesso processo metastatico 2. L’attuale articolo vengono illustrati gli aspetti pratici di un tipo relativamente nuovo di ex vivo modello della metastasi del polmone, il dosaggio di metastasi polmonare (PuMA) sviluppato da Mendoza e colleghi3, che fornisce uno strumento utile a scoprire nuovi driver molecolare nella progressione di metastasi del polmone in OS 4,5. Prima di procedere, tuttavia, sarebbe prudente toccare brevemente su diversi modelli correnti della metastasi, e come il modello PuMA offre diversi vantaggi rispetto ai convenzionali in vitro dosaggi.
Modelli più sperimentali usati per studiare metastasi dispongono di sistemi in vitro e in vivo che ricapitolano un passo specifico o diversi passaggi della cascata metastatica. Tali passaggi includono: 1) tumorale abbandonando il tumore primario, 2) intravasation nei vasi vicini (sangue o linfatico) e transito all’interno di circolazione, 3) arresto al sito secondario, 4) stravaso e sopravvivenza presso il sito secondario, formazione di 5) di micrometastasi e 6) crescita in metastasi vascolarizzate (Figura 1). Modelli in vitro di metastasi possono includere migrazione di 2-dimensionale (2D) e 3-dimensionale (3D) saggi di invasione di Matrigel che sono esaminati in dettaglio altrove 6. Per i modelli in vivo , i due sistemi di modello comunemente usate includono: 1) il modello della metastasi spontanea è dove un tumore le cellule sono orthotopically iniettato in un tipo specifico tessuto per formare un tumore locale che getta spontaneamente le cellule metastatiche ai luoghi distanti; 2) il modello della metastasi sperimentale è dove le cellule del tumore sono iniettate nel vaso sanguigno a monte dell’organo bersaglio. Ad esempio, un’iniezione della vena della coda dei risultati delle cellule del tumore nello sviluppo polmonare metastasi5,7,8. Altri modelli di metastasi sperimentali includono iniezione delle cellule del tumore nella milza o vena mesenterica che provoca lo sviluppo di metastasi epatiche9,10. Considerazioni pratiche di questi modelli in vivo sono discussi in dettaglio da Welch 11. Un altro modello in vivo utilizzato per lo studio di metastasi nei sarcomi pediatrici è il modello di impianto di subcapsular del tumore renale del rene che si traduce in formazione locale del tumore e metastasi spontanea per i polmoni 12,13. Una tecnica più tecnicamente impegnativa come videomicroscopia videomicroscopia può visualizzare direttamente, in tempo reale, interazioni tra cellule tumorali metastatiche e del microcircolo di un sito metastatico (cioè. polmone o fegato) come descritto da MacDonald14 ed Entenberg15, o lo stravaso delle cellule di cancro nella membrana corio-allantoidea come descritto da Kim 16.
Il modello di PuMA è un ex vivo, espianto del tessuto polmonare, il sistema di coltura chiuso dove la crescita delle cellule del tumore fluorescenti possa essere osservata longitudinalmente tramite microscopia a fluorescenza per un periodo di un mese (Vedi Figura 2A). Questo modello racchiude in sintesi le fasi iniziali di colonizzazione del polmone (passaggi da 3 a 5) in cascata metastatica. Alcuni vantaggi principali del modello PuMA rispetto ai modelli convenzionali in vitro sono: 1) fornisce la possibilità di misurare la crescita della cellula tumorale metastatico in un microambiente 3D che conserva molte delle caratteristiche del microambiente polmonare longitudinalmente vivo 3; 2) puMA consente al ricercatore di valutare se l’atterramento di un trattamento di gene o farmaco candidato ha attività anti-metastatica nel contesto di un microambiente polmonare 3D; 3) il modello di PuMA è flessibile con molti tipi di piattaforme di microscopia di fluorescenza (Figura 2B) come microscopia di fluorescenza widefield o microscopia confocale a scansione laser, esempi di ciascuno sono mostrati in Figura 2 & D, rispettivamente. Questo articolo verrà illustrato come utilizzare il modello di PuMA per ottenere dati di imaging longitudinali sulla crescita metastatica di migliorata della proteina fluorescente verde (eGFP)-che esprimono, le cellule umane di osteosarcoma metastatico ad alta e bassa (cellule MNNG e HOS, rispettivamente) utilizzando basso ingrandimento widefield fluorescenza. Esempi di un colorante fluorescente che etichette il parenchima polmonare e una proteina fluorescente rosso reporter genetici che etichette mitocondri in OS cellule nel modello PuMA mediante microscopia confocale a scansione laser imaging inoltre sono discussi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il seguente articolo tecnico descrive alcuni aspetti pratici del modello PuMA nello studio di colonizzazione del polmone in OS. Alcuni passaggi critici nel protocollo dove i ricercatori dovrebbero prestare particolare attenzione sono i seguenti:
a) inserimento di una canula della trachea. La trachea può essere facilmente danneggiata durante la dissezione del muscolo circostante e del tessuto connettivo. Inoltre, l’ago del catetere può essere inserito facilmente attraverso la trachea. Prestar…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare il Dr. Arnulfo Mendoza che ha fornito addestramento sulla tecnica di PuMA. Inoltre, vorremmo riconoscere la d. ssa Chand Khanna, Susan Garfield (NCI/NIH) e Sam Aparicio (BC Cancer Agency) per permettere l’utilizzo del loro microscopi nel corso di questo studio. Questa ricerca è stata sostenuta (in parte) dal programma di ricerca intramurale del National Institutes of Health, centro per la ricerca sul cancro, ramo di oncologia pediatrica. M.M.L. è stato sostenuto dal programma nazionale di istituti di salute intramurale visitando Fellow (premio 15335) e attualmente è supportato da un Fellowship di Parker Joan nella ricerca di metastasi. P.H.S è supportato da British Columbia Cancer Foundation.
Materials
| Table 2 | |||
| Cell culture reagents for A-media, B-media, and complete media | |||
| MNNG-HOS | ATCC | CRL-1547 | highly metastatic OS cell line |
| HOS | ATCC | CRL-1543 | poorly metastatic OS cell line |
| MG63.3 | Amy LeBlanc Laboratory (NCI) | N/A | highly metastatic OS cell line |
| MG63 | ATCC | CRL-1427 | poorly metastatic OS cell line |
| 10X M199 media | Thermofisher | 11825015 | Base media for A-media and B-media |
| Distilled Water (sterilized) | Thermofisher | 15230-147 | Component of A-media & B-media |
| 7.5% sodium bicarbonate solution | Thermofisher | 25080094 | Component of A-media & B-media |
| Hydrocortizone | Sigma-Alrich | H6909 | Component of A-media & B-media |
| Retinol acetate-water soluable | Sigma-Alrich | R0635-5MG | Component of A-media & B-media |
| Penicillin/Streptomycin 10X concentrated (10000 U/ml) solution | Thermofisher | 15140122 | Component of A-media & B-media, complete media. |
| Bovine insulin solution (10mg/ml) | Sigma-Alrich | I0516-5ML | Component of A-media & B-media |
| DMEM, high glucose | Thermofisher | 11965092 | Base media of Complete Media |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher | 25030081 | Component of Complete Media |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher | 16000044 | Component of Complete Media |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Thermofisher | 14190144 | Used in cell culture. |
| Hank’s Buffered Salts Solution, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermofisher | 14175095 | Used to resuspend cell pellet prior to injection |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermofisher | 25200114 | Used in cell culture. |
| DAR4M | Enzo | ALX-620-069-M001 | Used to label lung parenchyma. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 3 | |||
| Materials for PuMA | |||
| Zeiss 710 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Upright LSM confocal microscope |
| Zeiss 780 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Inverted LSM confocal microscope |
| SCID mice | Charles River | N/A | NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, female, age 6-8 weeks |
| GelFoam | Harvard Apparatus | 59-9863 | Used as a support for lung tissue sections. |
| SeaPlaque Agarose | Lonza | 50100 | Used during insufflation of the lung. |
| 1 ml syringe with 27 gauge needle | Fisherscientific | 14-826-87 | Used for tail vein injection. |
| 10 ml syringe | BD | 309604 | Used for insufflation of the lung. |
| 20 gauge catheter | Terumo | SR-OX2032CA | Used during insufflation of the lung. |
| Abbott IV extension set (30", Sterile) | Medisca | 8342 | Used during insufflation of the lung. |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | For wiping tail vein before injection |
| Sterile surgical gloves | Fisherscientific | Varies with size | Asceptic handing of mouse lungs |
| 30 cm ruler | Staples | Used for insufflation of the lung. | |
| Support stand for ruler | Pipette.com | HS29022A | Used for insufflation of the lung. |
| 35 mm glass-bottomed culture dish | Ibidi | 81158 | Used during imaging of lung slices |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | Used to line the sterile work area in the biological hood. |
| Catgut Plain Absorbable Suture | Braun | N/A | Used to tie off cannulated trachea. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 4 | |||
| Surgical instruments for PuMA | |||
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-5910 | For cutting lung sections |
| 4” (10 cm) Long Serrated Straight Extra Delicate 0.5mm Tip | Roboz | RS-5132 | For manipulating/holding lung sections. |
| 4” (10 cm) Long Serrated Slight Curve 0.8mm Tip | Roboz | RS5135 | For manipulating/holding lung sections. |
| Thumb Dressing Forceps; Serrated; Delicate; 4.5" Length; 1.3 mm Tip Width | Roboz | RS-8120 | For general dissection. |
| Thumb Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz | RS-8100 | For general dissection. |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp, 20mm blade | Roboz | RS-5880 | For general dissection. |
| Knapp Scissors; Straight; Sharp-Blunt; 27mm Blade Length; 4" Overall Length | Roboz | RS-5960 | For general dissection. |
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