Tweede harmonische generatie signalen in konijn Sclera als een instrument voor de beoordeling van de therapeutische weefsel dwarsbinding (TXL) voor bijziendheid

Summary

Dit protocol beschrijft technieken voor de beoordeling van de chemische cross-linking van het konijn sclera met behulp van tweede-harmonische generatie beeldvorming en differentiële scanning calorimetrie.

Abstract

Methoden ter versterking van weefsel door de invoering van chemische bindingen (niet-enzymatische dwarsbinding) tot structurele proteïnen (fibrillar collagens) voor therapie omvatten fotochemische dwarsbinding en weefsel (TXL) methoden dwarsbinding. Dergelijke methoden voor mechanische weefsel eigenschapswijzigingen inducerende gebruikt om het hoornvlies in hoornvlies dunner (mechanisch verzwakt) aandoeningen zoals keratoconus evenals de sclera in progressieve myopie, waar vermagering en verzwakking van de posterior Sclera optreedt en waarschijnlijk draagt bij aan de axiale rek. De eiwitten van de primaire doelgroep voor de versterking van dergelijke weefsel zijn fibrillar collagens, die de grote meerderheid van drooggewicht eiwitten in de cornea en sclera vormen. Toevalligerwijs, zijn fibrillar collagens de belangrijkste bron van tweede-harmonische generatie signalen in de extracellulaire ruimte van weefsel. Daarom, wijzigingen van de collageen-eiwitten, zoals degenen geïnduceerd door dwarsbinding therapieën, konden potentieel worden gedetecteerd en quantitated met behulp van tweede-harmonische generatie microscopie (SHGM). Bewaking SHGM signalen door het gebruik van een laser scanning microscopie systeem in combinatie met een infrarood excitatie licht bron is een spannende moderne beeldvorming methode dat is genieten van wijdverbreide gebruik in de Biomedische Wetenschappen. Dus de huidige studie werd uitgevoerd om te evalueren van het gebruik van SHGM microscopie als een middel voor het meten van geïnduceerde cross-linking effecten in ex vivo konijn sclera, na een injectie van een chemische stof dwarsbinding agent in de sub-Tenon ruimte (sT), een injectie aanpak dat is gebruikelijk voor het veroorzaken van oogbeschadigingen en/of verdoving tijdens oogheelkundig klinische procedures. De chemische stof dwarsbinding agent, is natrium hydroxymethylglycinate (SMG), van een klasse van cosmetische conserveermiddelen formaldehyde vrijgeven van agenten (FARs) genoemd. Scleral wijzigingen na reactie met SMG resulteerde in stijgingen van de SHG signalen en gecorreleerd met verschuivingen in thermische denaturatie temperatuur, een standaardmethode voor het evalueren van geïnduceerde weefsel dwarsbinding effecten.

Introduction

Progressieve myopie is gepostuleerd aan behandelbare door niet-enzymatische scleral dwarsbinding (fotochemische en/of chemische), wat logisch is gezien het feit dat het blokkeren van enzymatische cross-linking van collageen experimentele vorm ontbering (FD verhogen kan)-geïnduceerde bijziendheid¹. Sheikh en Phillips² onlangs gesproken over de haalbaarheid en de mogelijkheden voor het gebruik van standaard UV-A straling (UVA)-riboflavine gemedieerde fotochemische dwarsbinding (ook bekend als de Dresden-protocol), afgekort hier als (riboflavine CXL) voor achterste scleral stabilisatie axiale rek in bijziendheid halt toe te roepen. Deze fotochemische methode is met succes gebruikt voor de behandeling van destabilisatie van het anterieure globe-oppervlak gezien in keratoconus en post-LASIK keratectasia (d.w.z., het uitpuilende hoornvlies). Toepassing van dit protocol CXL voor de sclera wordt echter belemmerd door kwesties met betrekking tot moeilijkheden bij de toegang tot de achterste sclera met een ultraviolette lichtbron (UV), evenals de noodzaak om te wijzigen van een veel grotere weefsel oppervlakte. Dat gezegd zijnde, de CXL-aanpak is gebruikt om te stoppen axiale rek in visueel vorm beroofd konijnen (door tarsorrhaphy), hoewel meerdere regio’s van posterieure sclera meerdere afzonderlijke bestraling zones in die studie^{3 vereist}. Daarentegen kan de injectie van een chemische stabilisator en (dat wil zeggen, cross-linking agent) via de sT-ruimte een eenvoudiger manier om te wijzigen de posterieure sclera, het vermijden van de noodzaak voor de invoering van een UV-lichtbron vertegenwoordigen. Deze injectietechniek is bekend als een nuttige manier inducerende oogbeschadigingen en/of verdoving tijdens oogheelkundig procedures zoals cataract chirurgie^4,5,6. Wollensak⁷ eerder heeft beschreven van het gebruik van een injectie van de sT met behulp van glyceraldehyde (een chemische cross-linking agent gelijkaardig in concept aan de formaldehyde die het vrijgeven van agenten (FARs) beschreven in deze studie) aan het verharden van de sclera konijn en de genipin heeft is aangetoond dat het beperken van axiale lengte in FD cavia’s^8,9. Deze onderzoekers hebben aangetoond dat een duidelijk voordeel van het gebruik van een chemisch agens die oplosbaar over de fotochemische CXL-techniek. Dus scleral dwarsbinding met behulp van een injecteerbare chemisch agens van een soort, met inbegrip van de FARs (d.w.z., TXL)¹⁰, kon bieden een haalbaar behandelingsmethode de progressie van scleral rek gezien in bijziendheid halt toe te roepen.

In de protocollen die hier gepresenteerd, gebruiken we een chemische cross-linking oplossing van natrium hydroxymethylglycinate (SMG), geleverd via sT injectie aan de sclera van dode foetussen konijn ogen. Wij hebben uitgevoerd soortgelijke protocollen eerder voor actuele chemische dwarsbinding in het hoornvlies. Met name in die eerder gemeld studies, kan concentratie afhankelijke dwarsbinding effecten worden verkregen met behulp van SMG, met een effect bereik verspreid over ruim boven die haalbaar zijn met fotochemische CXL zoals bepaald door de thermische denaturatie analyse¹¹ .

We beschrijven hier protocollen voor de beoordeling van de cross-linking effect van SMG geleverd via sT injecties aan scleral weefsel, thermische denaturatie met behulp van differentiële Scanning Calorimetrie (DSC) en tweede harmonische generatie microscopie (SHGM).

Met behulp van differentiële scanning calorimetrie (DSC), ook bekend als thermische analyse, wordt een thermische denaturatie overgang gemeten, die voor scleral weefsel wordt hoofdzakelijk laten leiden door de eigenschappen van de fibrillar collagens, want zij de meerderheid van de bulk vormen van eiwit. Deze methode evalueert de stabiliteit van collageen moleculaire structuur en de kruiselings gekoppelde obligaties die de collageen fibrillen, de belangrijkste tertiaire eiwitstructuur stabiliseren. Tijdens de verwarming in de DSC, wordt de temperatuur van een kritische overgang bereikt die tot denaturatie van het molecuul van collageen leidt, wat resulteert in het uncoiling van de triple helix, een proces dat vormt wat is algemeen bekend als gelatine. Deze thermische denaturatie verstoort waterstofbruggen langs de collageen-molecuul en aan hogere temperaturen door geïnduceerde cross-linking methoden^12,13kan worden verschoven. Deze methode is gebruikt voor vele decennia, met name in de industrie biomaterialen en processen met leder te maken. Echter, deze methode vereist extractie van de sclera weefsel en dus kan alleen nuttig zijn als een ex vivo -techniek.

Tweede-harmonische generatie microscopie (SHGM) is gebaseerd op de niet-lineaire optische eigenschappen van bepaalde materialen, met niet-centrosymmetric moleculaire omgevingen. In dergelijke materialen, intens licht, bijvoorbeeld licht geproduceerd door lasers, genereert SHG signalen, waarin het invallende licht wordt verdubbeld in frequentie. Biologische stoffen waarvan bekend is dat het maken van de SHG signalen zijn collageen, microtubuli en spier myosin. Collageen enthousiast met een infrarood licht van 860 nm golflengte zal bijvoorbeeld een signaal van de SHG in het zichtbare bereik met 430 nm golflengte uitzenden. Tweede harmonische generatie (SHG) signaal imaging is een veelbelovende methode voor de beoordeling van de therapeutische collageen dwarsbinding. Het is gekend voor meer dan 30 jaar dat collageen fibrillen in weefsels SHG signalen^{14 uitstoten}. Echter kon pas onlangs hoge resolutiebeelden worden verkregen¹⁵ in een verscheidenheid van weefsel, met inbegrip van de pees¹⁶, kraakbeen¹⁷, huid en bloedvaten¹⁸, en in collageen gels¹⁹.

Deze studie is gebaseerd op deze kennis, en evalueert de SHG signaal veranderingen in de sclera via SMG chemisch geïnduceerde cross-linking van collageen. De resultaten wijzen erop dat SMG wijziging van de sclera de signalen van de SHG geproduceerd uit weefsel collageen vezelbundels (de hogere orde quaternaire structuur bestaat uit collageen fibrillen verhoogt) en ook een structurele morfologische veranderingen in de collageen produceert glasvezelnetwerk, weerspiegeld in de vezel bundel “straighten.”

Protocol

Alle procedures werden uitgevoerd met behulp van dode foetussen konijn ogen binnen intact outbred konijn hoofden. Alle institutionele en nationale richtsnoeren voor de verzorging en het gebruik van proefdieren werden gevolgd. 1. bereiding van de oplossingen SMG voorbereiding TXL: Bereiden 1 mL 0,2 M concentratie van natriumbicarbonaat oplossing (NaHCO3) oplossing met behulp van 0.0165 g NaHCO3 poeder opgelost in 1 mL gedestilleerd water. Los 0.1016 mg po…

Representative Results

Thermische denaturatie temperatuur (Tm) als een test method to evaluate methode TXL dwarsbinding effect: Een totaal van 16 paren van konijn ogen werden gebruikt in deze experimenten voor de TXL-procedure. Als een eerste deel van deze studie, werd de lokalisatie van cross-linking effect geïnduceerd door een enkele injectie van de cross-linking agent SMG via sT ruimte in het hoofd van dode foetussen konijn geëvalueerd. Dit type experiment sinds relevantie voor de klinisch…

Discussion

Uitgevoerde experimenten hebben aangetoond bewijs ter ondersteuning van het gebruik van de SHG signaal microscopie als een methode voor de evaluatie van collageen dwarsbinding effecten in sclera, verhogen van de toekomstige mogelijkheid van het gebruik van deze techniek als een controle-instrument voor de dwarsbinding behandelingen die gericht collageen eiwitten. Van de nota is een instrument al in klinische gebruik dat potentieel dit signaal SHG kan vangen. Hoewel dit instrument was vooral bedoeld voor imaging huid mens…

Materials

MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V	EMD Millipore, Massachusetts, USA		Double distilled, deionized water. – protocol step 1.1.1
Sodium hydroxymethylglycinate	Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USA		Crosslinking reagent – protocol step 1.1.2
Injection needle with luer-lock syringe	BD Eclipse, NJ, USA		Syringe for sub tenon injection. – protocol step 2.1
Rabbit head	La Granja poultry	Outbred	Rabbit head separated and delivered within 1 hour postmortem. – protocol step 2.2
Tono-pen	Reichter Technologies Depew, NY		IOP measurements – protocol step 2.4
DSC 6000 Autosampler	Perkin-Elmer Waltham, MA, USA		Thermal denaturation analyzer – protocol step 7.4
Pyris software	Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA	Ver 11.0	protocol step 7.5
CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MP	Nikon Instruments, Melville, NY, USA		A water immersionn objective with high IR transmittance with a working distance of 2.0 mm – protocol step 8.1.1.
GenTeal	Alcon, Fort Worth, TX	B000URVDQ8	Water-based gel used as objective immersion medium instead of water to prevent evaporation – 8.1.1
Chameleon Vision II	Coherent, Santa Clara,CA, USA		Ti:Sapphire pulsed laser with a 140 fs pulse width at 80 MHz and a tunable range from 680 nm to 1080 nm. – protocol step 8.1.11
AttoFluor cell chamber	Thermo Fisher Scientific Inc	A7816	Fixation of the cover slip – protocol step 8.1.3
25-mm round coverslips, #1.5	Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USA	GG-25-1.5	protocol step 8.1.3
Eclipse Ti-E	Nikon Instruments, Melville, NY, USA		protocol step 8.1.4.
Non-descanned (NDD) GaAsP detector	Nikon Instruments, Melville, NY, USA		Equipped with a 400-450 nm band pass filter – protocol step 8.1.7
A1R-MP laser scanning system	Nikon Instruments, Melville, NY, USA		Compatible with infrared (IR) multi-photon excitation. – protocol step 8.1.8
NIS Elements software	Nikon Instruments, Melville, NY, USA	Ver 4.3	refered to as "software" in the text – protocol step 8.1.9
Fiji/ImageJ	National Institute of Health		protocol step 9.1.2
NeuronJ	Eric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands		https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, for protocol step 9.2.2
Microsoft Excel	Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA	Ver 14	protocol step 9.2.8