Beoordeling van de bloed - hersenbarrière permeabiliteit door intraveneuze infusie van FITC-geëtiketteerden albumine in een muismodel van neurodegeneratieve ziekte
Summary
In deze studie presenteren wij een gemakkelijke en efficiënte procedure voor de beoordeling van de verstoring van de bloed – hersenbarrière neurodegeneratieve omstandigheden. Onze om doel te bereiken, we geïnfundeerd ultrahoog moleculair gewicht fluoresceïne isothiocyanaat geëtiketteerd (FITC)-albumine in muis jugular ader en de lekkage in de hersenen parenchym door fluorescentie microscopie geëvalueerd.
Abstract
Verstoring van de bloed – hersenbarrière (BBB) integriteit is een gemeenschappelijk kenmerk voor verschillende neurologische en neurodegeneratieve aandoeningen. Hoewel het samenspel tussen verontrust BBB homeostase en de pathogenese van hersenafwijkingen verder onderzoek moet, kunnen de ontwikkeling en validatie van een betrouwbare procedure nauwkeurig detecteren BBB wijzigingen doorslaggevend zijn en vertegenwoordigen een nuttig instrument voor het voorspellen van potentieel ziekte gerichte progressie en de ontwikkeling van therapeutische strategieën.
Hier presenteren we een gemakkelijke en efficiënte procedure voor het beoordelen van BBB lekkage in een neurodegeneratieve aandoening zoals die voorkomen in een preklinische muismodel van de ziekte van Huntington, waarin gebreken in de doorlaatbaarheid van BBB zijn duidelijk waarneembaar precociously in de ziekte. In het bijzonder de ultrahoog moleculair gewicht fluoresceïne isothiocyanaat geëtiketteerd (FITC)-albumine, die in staat is om over te steken de BBB alleen wanneer deze bijzondere waardevermindering heeft ondergaan, is acuut geïnfundeerd in de halsslagader van een muis en de distributie in de districten vasculaire of parenchymal vervolgens wordt bepaald door fluorescentie microscopie.
Accumulatie van groen fluorescent-albumine in de hersenen parenchym fungeert als een index van afwijkende BBB permeabiliteit en, wanneer de quantitated met behulp van J beeld processing software, wordt gerapporteerd als groene fluorescentie intensiteit.
Introduction
Homeostase binnen het centrale zenuwstelsel (CNS) is een voorwaarde voor de goede communicatie en de functie van de neuronale cellen. De CNS parenchym is strak afgesloten vanuit de periferie door het endotheel bloed – hersenbarrière (BBB), die vertegenwoordigt de interface tussen de perifere bloedbaan en de hersenen en speelt een centrale rol in de cross-talk tussen deze twee wijken1 ,2. De BBB is een complex en dynamisch driedimensionale structuur hoofdzakelijk samengesteld uit gespecialiseerde micro-schip endotheliale cellen (ECs) aan elkaar gekoppeld via intercellulaire regulates complexen – strakke kruispunten (TJs) – en omringd door pericytes, neuron uitgangen en Astrocyt voet processen1,2.
Onder fysiologische omstandigheden, de extreem lage permeabiliteit van de intact BBB zorgt voor de strikte regelgeving voor het vervoer van voedingsstoffen en andere moleculen in en uit de hersenen en de CNS biedt een unieke bescherming tegen veranderingen in de samenstelling van het bloed dat van invloed kan zijn op neurale activiteit en tegen potentiële perifere beledigingen1,2,3.
Verstoring van BBB integriteit en de verbeterde permeabiliteit heeft al lang bekend bij een sleutelelement vormen voor veel neurologische en neurodegeneratieve stoornissen4 met inbegrip van de ziekte van Huntington (HD)5,6, echter , een propagative gebeurtenis in de loop van de ziekte is nog steeds onduidelijk of deze een dysfunctie is een oorzakelijke fenomeen. De timing van BBB verdeling ook blijft ongrijpbaar, opkomende bewijs van onze fractie e.a. blijkt evenwel dat verstoord BBB integriteit niet leidt tot een late evenement in de progressie van de ziekte, maar eerder een begin stap6,7 , 8, die op lange termijn gevolgen kan hebben.
Met dit in gedachten is het belangrijk te onthullen precociously BBB verdeling in neurodegeneratie teneinde strategieën handig te voorspellen van de progressie van de ziekte en schade aan de hersenen en aan het ontwikkelen van alternatieve en meer gerichte interventies kunnen met succes beperking van de klinische gevolgen van een dergelijke verstoring. Betrouwbare beeldvorming van BBB bijzondere waardevermindering is daarom van groot belang in zowel experimenteel onderzoek en klinische behandeling van hersenziekten.
In deze paper beschrijven we een succesvolle en eenvoudige procedure voor de evaluatie van de permeabiliteit van de BBB in een muismodel HD met behulp van de ultrahoog moleculair gewicht fluoresceïne isothiocyanaat geëtiketteerd-albumine (FITC-albumine). Extravasation van FITC-albumine, die normaal gesproken niet de barrière, in de hersenen parenchym kruisen werd gemeten als een index van BBB lekkage. Deze techniek is gemakkelijk aanpasbaar aan ratten en andere pathologische condities gekenmerkt door cerebrovasculature bijzondere waardevermindering9,10.
Protocol
Representative Results
Discussion
De techniek die we hier beschrijven is vooral handig voor het opsporen van BBB lekkage onder ziekten van de hersenen. BBB disfunctie is het verkrijgen van aandacht als een gemeenschappelijk kenmerk van diverse neurologische aandoeningen,4. Wij vroeger deze aanpak voor het beschrijven van de vervroegde derangement van BBB integriteit in een muismodel van een zeldzame neurodegeneratieve ziekte zoals HD6.
Deze methode neemt voordeel van de relatieve…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door “Fondazione Neuromed” en gefinancierd door het Italiaanse ministerie van gezondheid “Ricerca Corrente” aan V.M.
Materials
| Albumin-fluorescin isothiocyanate conjiugate | SIGMA | A9771-100MG | |
| pAb anti-Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | |
| CY3 anti-rabbit made in goat | MILLIPORE | AP132 | |
| SUPERFROST PLUS | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Cover Slips 24 X 50 mm | Thermo Scientific (DIAPATH) | 61050 | |
| Kilik Optimal Cutting Temperature (OCT) compound | Bio Optica | 05-9801 | |
| VECTASHIELD Mounting Media | VECTOR | H-1500 | Mounting media with DAPI |
| iNSu/Light Insulin Disposible Syringe | RAYS Health &Safety | INS1ML26G13 | |
| 30G 1/2" | BD Microlance | 304000 | Needle for Insulin disposible Syringe |
| Scalpel Handle | F.S.T. | 91003-12 | |
| #22 Disposable Scalpel blads | F.S.T. | 10022-00 | |
| Fine Iris scissors 10.5 cm | F.S.T. | 14094-11 | |
| Dumont Forceps #5745 45° 0.10 x 0.06 mm | F.S.T. | 11251-35 | |
| Graefe Forceps 10 cm | F.S.T. | 11051-10 | |
| Dumont Forceps #5 0.1 X 0.06 mm | F.S.T. | 11251-20 | |
| Medical patch | Medicalis | 34788 | |
| Sterile disposable towel drape | Dispotech | TVO50VE | |
| Stereoscopic Microscope | NIKON | SMZ 745 T | |
| Optic Illuminator LED light (C-FLED2) | NIKON | 1003167 | Optic Illuminator for Stereoscopic Micrscope |
| Eclipse Ni-U Microscope | Nikon | 932162 | Epifluorescence Microscope |
| Microscope digital Camera | Nikon | DS-Ri2 | Microscope camera |
| Intenslight | Nikon | C-HGFI | Microscope lamp |
| NIS-Elements 64 bit | Nikon | AR 4.40.00 | Analysis Software |
| Electric Razor | Gemei | GM-3007 |
References
- Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handb Clin Neurol. 133, 39-59 (2016).
- Serlin, Y., Shelef, I., Knyazer, B., Friedman, A. Anatomy and physiology of the blood-brain barrier. Semin Cell Dev Biol. 38, 2-6 (2015).
- Moretti, R., et al. Blood-brain barrier dysfunction in disorders of the developing brain. Front Neurosci. 9, 40 (2015).
- Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier. Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).
- Drouin-Ouellet, J., et al. Cerebrovascular and blood-brain barrier impairments in Huntington’s disease: Potential implications for its pathophysiology. Ann Neurol. 78 (2), 160-177 (2015).
- Di Pardo, A., et al. Impairment of blood-brain barrier is an early event in R6/2 mouse model of Huntington Disease. Sci Rep. 7, 41316 (2017).
- Lecler, A., Fournier, L., Diard-Detoeuf, C., Balvay, D. Blood-Brain Barrier Leakage in Early Alzheimer Disease. Radiology. 282 (3), 923-925 (2017).
- van de Haar, H. J., et al. Blood-Brain Barrier Leakage in Patients with Early Alzheimer Disease. Radiology. 282 (2), 615 (2017).
- Fernandez-Lopez, D., et al. Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat. J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).
- Yang, Y., Rosenberg, G. A. Blood-brain barrier breakdown in acute and chronic cerebrovascular disease. Stroke. 42 (11), 3323-3328 (2011).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. (6), e239 (2007).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice. J Vis Exp. (9), e404 (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- McCloy, R. A., et al. Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events. Cell Cycle. 13 (9), 1400-1412 (2014).
- Burgess, A., et al. Loss of human Greatwall results in G2 arrest and multiple mitotic defects due to deregulation of the cyclin B-Cdc2/PP2A balance. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (28), 12564-12569 (2010).
- Krueger, M., Hartig, W., Reichenbach, A., Bechmann, I., Michalski, D. Blood-brain barrier breakdown after embolic stroke in rats occurs without ultrastructural evidence for disrupting tight junctions. PLoS One. 8 (2), e56419 (2013).
- Hirano, A., Kawanami, T., Llena, J. F. Electron microscopy of the blood-brain barrier in disease. Microsc Res Tech. 27 (6), 543-556 (1994).
