Подготовка первичных острый лимфобластный лейкоз клеток в разных клеточного цикла этапов, центробежные сцеживания
Summary
Этот протокол описывает использование центробежных сцеживания для разделения клетки первичной острый лимфобластный лейкоз на фазы различных клеточного цикла.
Abstract
Возможность синхронизации клеток был центральным для продвижения нашего понимания регуляции клеточного цикла. Общие методы, используемые включают лишение сыворотки; химические вещества, которые аресту клеток в разных клеточного цикла этапов; или использование митотическая трясти-Off которая эксплуатирует их снижение присоединения. Однако все из них имеют недостатки. Например голод сыворотки работает хорошо для нормальных клеток, но менее хорошо для опухолевых клеток с нарушенной клеточного цикла контрольно-пропускных пунктах из-за потери подавитель онкогена активации или опухоли. Аналогичным образом химически обработанную клеточных популяций может гавани наркотиков индуцированного повреждения и показать изменения, связанные со стрессом. Техника, которая обходит эти проблемы — противотоком центробежные сцеживания (КЦВ), где клетки подвергаются два противостоящих сил, центробежная сила и скорость жидкости, которая приводит к разделение ячеек на основе размера и плотности. Поскольку клетки продвижения через цикл обычно увеличить, КЦВ может использоваться для разделения клетки на фазы различных клеточного цикла. Здесь мы применяем этот метод к клеткам первичных острый лимфобластный лейкоз. При оптимальных условиях по существу чисто населения клеток в фазе G1 и высокообогащенного популяция клеток в фазы G2/М можно получить отличные урожайности. Эти популяции клеток идеально подходят для изучения механизмов клеточного цикла зависимые действия противоопухолевых препаратов и других приложений. Мы также показать, как изменения стандартной процедуры может привести к неоптимальной производительности и обсудить недостатки метода. Подробная методология представлена должно облегчить применение и разведки технику для других типов клеток.
Introduction
Культивируемых клеток обычно растут асинхронно и отдельные клетки присутствуют в различных стадиях клеточного цикла. Некоторые организмы демонстрируют естественно синхронных клеток циклов или могут быть синхронизированы с конкретных физиологических раздражителей. Например ядра в гигантских плазмодия миксомицеты Physarum polycephalum разделить в весьма синхронных моды1и клетки зелёных водорослей, которые Desmodesmus quadricauda могут быть синхронизированы с чередующихся светлых и темных периоды2. Хотя такие организмы предлагают уникальные экспериментальные атрибуты, они недостаточно модель сложности mammalian клеток. Возможность искусственно синхронизации клеток млекопитающих населения был центральным для продвижения нашего понимания регуляции клеточного цикла и молекулярные основы клеточного цикла контрольно-пропускных пунктов. Распространенные методы включают лишение сыворотки, химических блока и выпуска или эксплуатации физические характеристики3,4. Снятие сыворотки часто вызывает клетки ввести покоя, и повторное добавление сыворотки способствует повторный клеточный цикл в фазе G15. Химические ингибиторы включают агентов, таких как избыток тимидина или гидроксимочевина, который блокирует клетки на границе G1/S или микротрубочек ингибиторов, которые обычно арест клетки в M фазы3,4. Подходы, которые эксплуатируют физические характеристики включают митотическая трясти офф который может использоваться для обогащения для митотическая клетки так как они являются менее адэрентных чем межфазной клетки6. Однако все эти методы имеют потенциальные недостатки. Например не все типы клеток поддерживать жизнеспособность в отсутствии сыворотки или наличие химических ингибиторов, а доходность клеток после митотическая трясти офф ограничено без предварительного синхронизации с митотическая ингибиторов.
За исключением ранних эмбриональных клеток циклов, где клетки постепенно уменьшаться в размерах, как они делят7, большинство клеток, продвижения через цикл прохождения фаз роста и стать больше. Это свойство используется в технике противоточные центробежные сцеживания (КЦВ), который может использоваться для разделения клетки, различающихся по размеру и следовательно в клеточный цикл фазы8,9. Во время КЦВ, клетки находятся под влиянием двух противостоящих сил: центробежные силы, которые побуждают клетки от оси вращения и жидкости скорости (противоток), который управляет клетки к оси вращения (рис. 1). Клетки в зале сцеживания достичь равновесия, где эти силы равны. Ключевыми факторами, диктуя положения равновесия являются диаметр ячеек и плотности. Как поток увеличивается скорость буферного раствора и силы сопротивления противоточные перевешивает центробежной силы, устанавливается новое равновесие, вызывая изменения в положении клеток внутри камеры. Все клетки смещается в сторону выхода камеры, результате поменьше, оставляя камеры сначала, тогда как более крупные клетки остаться внутри камеры до тех пор, пока противоточные ставка увеличивается недостаточно для содействия их выхода. Клетки, спасаясь сцеживания камеры с подряд увеличение темпов противоточные могут быть собраны в определенных фракций и каждая часть содержит клетки последовательно увеличения размеров. Вместо проведения сцеживания с прирост темпов противоточные, последовательно уменьшается в центробежных сил, уменьшив скорость центрифугирования достигнет того же результата. Процесс сцеживания требует оптимизации в зависимости от типа клеток, сцеживания буфер занятых и конкретные используемые приборы. Скорость оседания клеток в этих условиях лучше всего описал закон Стокса: SV = [d2(ρp– ρм) / 18η] .ω2r, где SV = скорость седиментации; d = диаметр частицы; P ρ = плотность частиц; M ρ = плотность буфера; Η = вязкость буфера; Ω = угловой скорости ротора; и r = радиальный позиция частицы. Таким образом SV пропорциональна диаметр ячеек и плотности, и так как диаметр, возведенное в степень второго, он способствует более значительно, чем плотность, которая обычно постоянна через клеточного цикла.
Важным преимуществом КЦВ, что клетки не подвергаются суровым условиям химической обработки или недостатке питания и могут быть восстановлены в отличную доходность по существу невозмущенной. Требованием является, что в вопросе клетки проходят значительное увеличение в диаметре, по крайней мере 30%, как они пересекают клеточного цикла. Основным недостатком является стоимость специализированных центрифуги, ротора и аксессуары. Тем не менее возможность готовить клетки, обогащенная КЦВ в конкретных клеточного цикла этапов значительно облегчило исследования клеточного цикла в организмах из дрожжевых клеток млекопитающих9,10. Кроме того последние достижения расширяют использует для разделения клетки от здоровых против раковой ткани, разделение различных типов клеток в гетерогенных смесей, а также производства конкретных клеток видов иммунотерапии9.
Наш основной интерес был в понимании механизма действия ориентации агенты (MTA), такие как алкалоиды барвинка и таксаны микротрубочек. Считается, что эти препараты были действовать исключительно в митозе, блокировка шпинделя микротрубочек функции11,12, однако последние данные свидетельствуют о том, что они могут также нацелены на межфазной микротрубочек13,14. Мы недавно сообщили, что первичный острый лимфобластный лейкоз (все) клетки проходят смерти в любой фазе G1 или в М фазы при обработке винкристин и других MTA в обнаруживавшие клеточного цикла15. Возможность разделить все клетки различных клеточный цикл фазы КЦВ сыграл важную роль в достижении этот вывод. В этой статье мы описать технические детали и предлагают практические советы для применения КЦВ в подготовке первичного все клетки в разных клеточного цикла этапов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы описали метод получения первичной все клетки в различных стадиях клеточного цикла, используя КЦВ. При оптимальных условиях по существу чисто населения клеток в фазе G1 и высокообогащенного популяция клеток в фазы G2/М могут легко быть получены отличные урожайности, и клеток в S фазе вы…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана низ CA109821 (для TCC). Мы благодарим Beckman Coulter, щедро предоставляет средства для покрытия расходов на публикации и для оказания технической помощи в настройке и эксплуатации системы сцеживания. Мы благодарим д-р Фред Фалкенбург за предоставление первоначального начальных всех культур.
Materials
| Hanks' balanced salt solution | Lonza | 10-508Q | 1 L bottle |
| Fetal Plus bovine serum | Atlas Biologicals | FP-0500-A | 500 mL bottle |
| 2-napthol-6,8-disulfonic acid dipotassium salt | Acros Organics | 212-672-4 | 100 g powder |
| 50 mL concial tubes | Denville Scientifics | C1062-P | 500/case |
| PES Membrane 0.22 µm filter unit | Millipore | SLGP033RB | 250/pack |
| Avanti J-26S XPI w/ Elut. Non-IVD – 50/60 Hz, 200/208/240V | Beckman Coulter | B14544 | centrifuge compatible with elutriation system |
| JE 5.0 elutriator rotor kit | Beckman Coulter | 356900 | rotor kit which includes the rotor, T-handle hex wrench, the quick release assembly (w/o the elutriation chamber), anchoring cable, and the strobe assembly |
| Chamber, standard, 4-mL, "A" | Beckman Coulter | 356943 | standard elutriation chamber |
| Masterflex L/S Easy-Load pump head | Cole-Parmer | EW-07518-10 | |
| Masterflex L/S Variable-Speed Drive | Cole-Parmer | EW-07528-10 | |
| Masterflex BioPharm platinum-cured silicone pump tubing, L/S 16 | Cole-Parmer | EW-96420-16 | |
| 25 G x 1.5 Precision Glide needle | BD | 305127 | sterile, single-use needles |
| 10 mL Luer-Lok syringe | BD | 309604 | sterile, single-use syringes |
| Vi-Cell XR | Beckman Coulter | 383556 | |
| PI/RNase staining buffer | BD Pharmingen | 550825 | propidium iodide/RNase staining buffer |
| cyclin B1 (GNS1) mouse monoclonal IgG antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-245 | |
| cyclin D1 (DCS-6) mouse monoclonal IgG antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20044 | |
| P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology | 8516s | |
| GAPDH (14C10) rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology | 2118s | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugate | BioRad | 170-6516 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)-HRP conjugate | BioRad | 170-6515 |
References
- Beach, D., Piper, M., Shall, S. Isolation of newly-initiated DNA from the early S phase of the synchronous eukaryote, Physarum polycephalum. Exp cell res. 129, 211-221 (1980).
- Sevcikova, T., et al. Completion of cell division is associated with maximum telomerase activity in naturally synchronized cultures of the green alga Desmodesmus quadricauda. FEBS letters. 587, 743-748 (2013).
- Rosner, M., Schipany, K., Hengstschlager, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nat protoc. 8, 602-626 (2013).
- Banfalvi, G. Overview of cell synchronization. Meth mol biol. 761, 1-23 (2011).
- Langan, T. J., Rodgers, K. R., Chou, R. C. Synchronization of Mammalian Cell Cultures by Serum Deprivation. Meth mol biol. 1524, 97-105 (2017).
- Dulla, K., Margalef, A. S. Large-Scale Mitotic Cell Synchronization. Meth mol biol. 1524, 65-74 (2017).
- Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species. Comp biochem physiol Toxicol,pharmacol CBP. 178, 8-15 (2015).
- Banfalvi, G. Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation. Nat protoc. 3, 663-673 (2008).
- Grosse, J., Meier, K., Bauer, T. J., Eilles, C., Grimm, D. Cell separation by countercurrent centrifugal elutriation: recent developments. Prep biochem,biotechnol. 42, 217-233 (2012).
- Smith, J., Manukyan, A., Hua, H., Dungrawala, H., Schneider, B. L. Synchronization of Yeast. Meth mol. 1524, 215-242 (2017).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?. J cell sci. 122, 2579-2585 (2009).
- Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. Killing cells by targeting mitosis. Cell death diff. 19, 369-377 (2012).
- Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D., Wilkerson, J., Fojo, T. Mitosis is not a key target of microtubule agents in patient tumors. Nature reviews. Clinic oncol. 8, 244-250 (2011).
- Furst, R., Vollmar, A. M. A new perspective on old drugs: non-mitotic actions of tubulin-binding drugs play a major role in cancer treatment. Die Pharmazie. 68, 478-483 (2013).
- Kothari, A., Hittelman, W. N., Chambers, T. C. Cell Cycle-Dependent Mechanisms Underlie Vincristine-Induced Death of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells. Cancer res. 76, 3553-3561 (2016).
- Nijmeijer, B. A., et al. Long-term culture of primary human lymphoblastic leukemia cells in the absence of serum or hematopoietic growth factors. Exp hematol. 37, 376-385 (2009).
- Knudsen, E. S., Wang, J. Y. Dual mechanisms for the inhibition of E2F binding to RB by cyclin-dependent kinase-mediated RB phosphorylation. Mol Cell Bio. 17, 5771-5783 (1997).
- Malumbres, M., Barbacid, M. Mammalian cyclin-dependent kinases. Trends biochem sci. 30, 630-641 (2005).
- Liang, H., Hittelman, W., Nagarajan, L. Ubiquitous expression and cell cycle regulation of the protein kinase PIM-1. Arch biochem biophys. 330, 259-265 (1996).
- Sen, S., et al. Expression of a gene encoding a tRNA synthetase-like protein is enhanced in tumorigenic human myeloid leukemia cells and is cell cycle stage- and differentiation-dependent. Proc Natl Acad Sci USA. 94, 6164-6169 (1997).
- Ly, T., Endo, A., Lamond, A. I. Proteomic analysis of the response to cell cycle arrests in human myeloid leukemia cells. eLife. 4, (2015).
