离心淘洗制备不同细胞周期的原发性急性淋巴细胞白血病细胞
Summary
本议定书描述了使用离心淘洗分离原发性急性淋巴细胞白血病细胞到不同的细胞周期阶段。
Abstract
同步细胞的能力一直是促进我们对细胞周期调节的理解的中心。常用的技术包括血清剥夺;在不同的细胞周期阶段逮捕细胞的化学物质;或使用有丝分裂 shake-off, 利用其减少粘附。然而, 所有这些都有缺点。例如, 血清饥饿对正常细胞很有效, 但对于因癌基因活化或肿瘤抑制丧失而受损的细胞周期检查点的肿瘤细胞来说, 效果却不那么好。同样地, 经过化学处理的细胞群可以产生药物引起的损伤, 并显示与压力相关的改变。绕过这些问题的一种技术是逆流离心淘洗 (CCE), 在这里, 细胞受到两种相反的作用力, 离心力和流体速度, 导致细胞在大小和密度的基础上分离。由于细胞通过周期的推进通常会扩大, CCE 可用于将细胞分离成不同的细胞周期阶段。我们将此技术应用于原发性急性淋巴细胞白血病细胞。在最佳条件下, G1 期细胞的基本纯种群和 G2/M 期细胞的高富集率可获得优良的产量。这些细胞的数量非常适合研究抗癌药物和其他应用的细胞周期依赖性机制。我们还展示了对标准过程的修改如何导致次优的性能, 并讨论了技术的局限性。所提出的详细方法应有助于对其他类型的细胞进行技术的应用和探索。
Introduction
培养细胞通常以异步方式生长, 而单个细胞则存在于细胞周期的不同阶段。有些有机体自然地陈列同步细胞周期或可以由具体生理刺激同步。例如, 在粘液霉菌的巨型疟原虫中的细胞核,多头多头在高度同步的方式下进行了1, 绿藻的细胞Desmodesmus quadricauda可以通过交替的光和暗来同步期间2。虽然这些生物体提供了独特的实验特性, 但它们没有充分地模拟哺乳动物细胞的复杂性。人工同步哺乳动物细胞的能力一直是促进我们对细胞周期调节和细胞周期检查点的分子基础的理解的中心。常见的方法包括血清剥夺, 化学阻滞和释放, 或利用物理特性3,4。血清的提取经常导致细胞进入平静, 并且血清的 re-addition 促进细胞周期再入进入 G1 阶段5。化学抑制剂包括诸如过多的胸苷或羟基的药物, 这些因子阻断了 G1/S 边界的细胞, 或通常在 M 阶段34中逮捕细胞的微管抑制剂。利用物理特性的方法包括有丝分裂 shake-off, 它可以用来丰富有丝分裂细胞, 因为它们比相间细胞的黏附性小6。然而, 所有这些技术都有潜在的缺点。例如, 并非所有的细胞类型在缺乏血清或化学抑制剂存在的情况下都保持生存能力, 有丝分裂 shake-off 后细胞的收率是有限的, 不需要事先与有丝分裂抑制剂同步。
除了早期的胚胎细胞周期, 当细胞分裂为7时, 它们的大小逐渐减小, 但大多数细胞在循环中前进, 经历了生长阶段, 变得更大。此属性在逆流离心淘洗 (CCE) 技术中被利用, 它可用于分隔大小不同的单元格, 从而在单元周期阶段8,9中分离。在 CCE 期间, 细胞受到两种相反的作用力的影响: 离心力, 它驱动细胞远离自转轴, 流体速度 (逆流), 它驱动细胞朝向旋转轴 (图 1)。在淘洗室的细胞达到平衡的位置, 这些力量是平等的。支配平衡位置的关键因素是细胞直径和密度。随着缓冲液流速的增加, 逆流阻力大于离心力, 建立了新的平衡, 引起腔内细胞位置的变化。所有的细胞都被转移到腔室的出口, 导致较小的单元先离开腔室, 而较大的细胞则留在腔室内, 直到逆流率增加, 以促进其退出。淘洗室逃逸的细胞, 连续增加逆流率, 可以收集在特定的分数和每个分数包含按顺序增加大小的细胞。随着逆流速率的增加, 离心速度的下降会导致离心力的连续下降, 而不是淘洗。淘洗的过程需要根据细胞类型、使用的淘洗缓冲器和所用的特定仪器进行优化。在这些条件下, 细胞沉淀的速率最好用斯托克斯定律描述: sv = [d2(ρp-ρm)/18η]. ω2r, 其中 sv = 沉淀速度;d = 微粒的直径;ρp = 粒子的密度;ρm = 缓冲区的密度;η = 缓冲器的粘度;ω = 转子的角速度;和 r = 粒子的径向位置。因此, SV 与细胞直径和密度成正比, 因为直径被提高到第二个功率, 它的贡献比密度通常是通过细胞周期常数。
CCE 的一个重要优点是, 细胞不受化学治疗或营养缺乏的苛刻条件的影响, 可以在良好的产量中恢复, 基本上是泰然自若的。一个要求是, 当它们遍历细胞周期时, 所讨论的细胞直径会显著增加, 至少有30%。主要缺点是专用离心机、转子和附件的成本。尽管如此, 通过 CCE 培养细胞在特定细胞周期阶段富集的能力, 极大地促进了细胞周期研究从酵母到哺乳动物细胞9,10。此外, 最近的进展是扩大用于分离的细胞从健康与癌组织, 分离不同的细胞类型在异构混合物, 并生产特定的细胞类型的免疫治疗的9。
我们的主要兴趣是了解微管靶向剂 (mta) 的作用机制, 如长春生物碱和紫杉。这些药物被认为完全是在有丝分裂, 阻断纺锤微管功能11,12, 但最近的证据表明它们也可能靶向界面微管13,14。我们最近报告说, 原发性急性淋巴细胞白血病 (所有) 细胞在 G1 期或 M 期发生死亡时, 以长春新碱和其他 mta 的细胞周期依赖性的方式处理15。通过 CCE 将所有细胞分离成不同的细胞周期阶段的能力有助于达到这个结论。在本文中, 我们描述的技术细节, 并提供实用的技巧, CCE 的应用, 以准备在不同的细胞周期阶段的主所有细胞。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们描述了使用 CCE 在细胞周期的不同阶段获得主所有细胞的方法。在最佳条件下, G1 相中的细胞的基本纯种群和 G2/M 期细胞的高度丰富的种群可以很容易地获得优良的产量, 如果需要的话, 在 S 相中高度丰富的细胞也可以得到。这里提出的结果是使用一个主要的所有文化 (特别是, ALL-5), 并取得了基本上相同的结果, 与独立的文化, ALL-215。另外, 所有其他主要的所有文化在异步增长?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了 NIH CA109821 的支持。我们感谢贝克曼-库尔特慷慨提供资金, 以支付出版费用和在淘洗系统的设置和运作方面的技术援助。我们感谢 Dr. 弗雷德 Falkenburg 提供初始的主要的所有文化。
Materials
| Hanks' balanced salt solution | Lonza | 10-508Q | 1 L bottle |
| Fetal Plus bovine serum | Atlas Biologicals | FP-0500-A | 500 mL bottle |
| 2-napthol-6,8-disulfonic acid dipotassium salt | Acros Organics | 212-672-4 | 100 g powder |
| 50 mL concial tubes | Denville Scientifics | C1062-P | 500/case |
| PES Membrane 0.22 µm filter unit | Millipore | SLGP033RB | 250/pack |
| Avanti J-26S XPI w/ Elut. Non-IVD – 50/60 Hz, 200/208/240V | Beckman Coulter | B14544 | centrifuge compatible with elutriation system |
| JE 5.0 elutriator rotor kit | Beckman Coulter | 356900 | rotor kit which includes the rotor, T-handle hex wrench, the quick release assembly (w/o the elutriation chamber), anchoring cable, and the strobe assembly |
| Chamber, standard, 4-mL, "A" | Beckman Coulter | 356943 | standard elutriation chamber |
| Masterflex L/S Easy-Load pump head | Cole-Parmer | EW-07518-10 | |
| Masterflex L/S Variable-Speed Drive | Cole-Parmer | EW-07528-10 | |
| Masterflex BioPharm platinum-cured silicone pump tubing, L/S 16 | Cole-Parmer | EW-96420-16 | |
| 25 G x 1.5 Precision Glide needle | BD | 305127 | sterile, single-use needles |
| 10 mL Luer-Lok syringe | BD | 309604 | sterile, single-use syringes |
| Vi-Cell XR | Beckman Coulter | 383556 | |
| PI/RNase staining buffer | BD Pharmingen | 550825 | propidium iodide/RNase staining buffer |
| cyclin B1 (GNS1) mouse monoclonal IgG antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-245 | |
| cyclin D1 (DCS-6) mouse monoclonal IgG antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20044 | |
| P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology | 8516s | |
| GAPDH (14C10) rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology | 2118s | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugate | BioRad | 170-6516 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)-HRP conjugate | BioRad | 170-6515 |
References
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