Bestimmung genomweite Transkript Verfall Tarife im wuchernden und ruhenden menschlichen Fibroblasten
Summary
Wir beschreiben ein Protokoll für die Generierung von wuchernden und ruhenden primären menschlichen dermalen Fibroblasten, Überwachung Transkript Verfall Preise und differentiell verfallenden Gene zu identifizieren.
Abstract
Ruhe ist eine temporäre, reversibel in die Zellen Zellteilung aufgehört haben, aber weiterhin in der Lage zu vermehren. Mehrere Studien, einschließlich der unsrigen, haben gezeigt, dass Ruhe weitverbreitete Änderungen in der Genexpression zugeordnet ist. Einige dieser Veränderungen entstehen durch Veränderungen in der Ebene oder die Aktivität der Verbreitung-assoziierten Transkriptionsfaktoren, wie E2F und MYC. Wir haben bewiesen, dass mRNA Zerfall auch auf Veränderungen in der Genexpression zwischen proliferierende und ruhende Zellen beitragen kann. In diesem Protokoll beschreiben wir das Verfahren für die wuchernde und ruhende Kulturen der menschliche Vorhaut dermalen Fibroblasten. Wir beschreiben die Verfahren zur Hemmung der neue Transkription in proliferierende und ruhende Zellen mit Actinomycin D (ActD). ActD-Behandlung stellt einen einfache und reproduzierbaren Ansatz zu Wehre neue Transkription von Transkript Verfall dar. Ein Nachteil des ActD-Behandlung ist, dass der zeitliche Verlauf auf einem kurzen Zeitrahmen beschränkt sein muss, da ActD Zellviabilität auswirkt. Transkript-Spiegel sind im Laufe der Zeit zur Abschrift Zerfall bestimmen überwacht. Dieses Verfahren ermöglicht die Identifikation von Genen und Isoformen, die differenzielle Zerfall im wuchernden versus Ruhestrom Fibroblasten aufweisen.
Introduction
Steady-State widerspiegeln Protokolle den Beitrag der Abschrift Synthese und Transkript Verfall. Reguliert und koordiniert Transkript Zerfall ist ein wichtiger Mechanismus zur Steuerung von biologischen Prozessen1,2,3,4. Zum Beispiel wurden Transkript Verfall Preise gezeigt beizutragen, die zeitliche Abfolge der Ereignisse, die nach Aktivierung durch inflammatorische Zytokin Tumor-Nekrose-Faktor5.
Wir haben bisher gezeigt, dass der Übergang zwischen Verbreitung und Ruhe im primären menschlichen Fibroblasten mit Veränderungen in der Abschrift von vielen Genen6verbunden ist. Einige dieser Änderungen spiegeln Unterschiede in der Aktivität von Transkriptionsfaktoren zwischen diesen beiden Zuständen.
Änderungen in eine Abschrift Zerfallsrate können auch zu Änderungen bei der Ausdruck eine Abschrift in zwei verschiedenen Staaten7,8beitragen. Basierend auf unserer früheren Feststellungen, dass der Übergang zwischen Verbreitung und Ruhe verbunden mit Veränderungen in der Höhe von mehreren RNAs9wir gefragt, ob es auch ein Beitrag von differenziellen Transkript Verfall in der Veränderung ist Genexpression in versus Ruhestrom Fibroblasten vermehren.
Um die Abschrift Stabilität zu überwachen, haben wir die Rate des Zerfalls der Transkripte genomweite in versus ruhenden Zellen wuchern festgestellt. Um dies zu erreichen, überwachen wir Verfall Preise im wuchernden versus Ruhestrom Fibroblasten durch die Einführung eines Inhibitors der neue Transkription und Überwachung die Rate an die einzelnen Protokolle im Laufe der Zeit verschwunden. Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass im Vergleich zu Methoden, die einfach insgesamt Genexpression, überwachen, indem Sie neue Transkript-Synthese hemmen, werden wir in der Lage die Zerfallsrate für diese Protokolle getrennt von der Rate, mit der sie bestimmen transkribiert.
ActD Behandlung neue Transkription hemmen und Transkript Verfall Preise bestimmen wurde erfolgreich in mehreren früheren Studien angewendet. ActD wurde zur sezieren der Bedeutungdes der RNA-Stabilität in die Änderungen in Hülle und Fülle der Niederschrift, die von einer Behandlung mit Pro-inflammatorischen Zytokinen5ergeben. Ein ähnlicher Ansatz hat auch zur sezieren die Unterschiede im Transkript Zerfallsrate in versus differenzierten C2C12 Zellen wuchern, wie sie eine differenzierte Muskel Phänotyp10annehmen. Als weiteres Beispiel globale mRNA Halbwertszeiten auch in pluripotente erkannt wurden und differenzierte Maus embryonale Stammzellen-11. In diesen Beispielen nachweislich die mRNA Decay für die Regulierung der Abschrift Fülle und für den Übergang von Zellen in andere Zelle Staaten von Bedeutung sein.
Die nachfolgend beschriebenen Methoden anwenden, entdeckten wir Steuersatzänderungen Transkript Zerfall in ungefähr 500 Gene beim Vergleich von Fibroblasten in proliferierende und ruhende Staaten12. Insbesondere, entdeckten wir, dass die Ziele der MicroRNA MiR-29, die in ruhenden Zellen herunterreguliert, stabilisiert werden, wenn Zellen in Ruhe übergehen. Wir beschreiben hier die Methode verwendeten wir Zerfall in proliferierende und ruhende Zellen zu bestimmen. Diese Methode eignet sich für Zinsprodukten mRNA Zerfall in zwei unterschiedliche, aber ähnliche Bedingungen zu vergleichen, wenn Informationen über rasch verfallenden Genen gesucht wird. Es könnte auch verwendet werden, andere Fragen wie die Wirkung der Zelle Kulturbedingungen auf Transkript Zerfall, zum Beispiel in zweidimensional im Vergleich zu drei dimensionale Kulturen anzusprechen. Decay Rate können bestimmt genomweite mit Methoden wie Microarrays oder RNA-FF alternativ in Echtzeit qPCR oder Nordbeflecken kann verwendet werden, um Verfall auf gen-durch-gen oder Isoform von Isoform Basis zu bestimmen. Diese Sätze können dann verwendet werden, um die Halbwertszeit von jedem überwachten gen zu berechnen und Gene mit Verfall zu identifizieren, die in zwei Bedingungen unterschiedlich sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stille kann durch externe Signale einschließlich Rücknahme Mitogene oder Serum, mangelnde Zelladhäsion und Kontakt Hemmung induziert werden. Kontakt-Hemmung, einer von mehreren möglichen Methoden zur Induktion der Ruhe, ist ein höchst evolutionär konservierte Prozess in dem Zellen der proliferativen Zellzyklus in Reaktion auf Zell-Zell-Kontakt beenden. Wir konzentrieren uns hier auf Kontakt Hemmung als Beispiel für eine Methode, um Ruhe zu induzieren. Frühere Studien haben berichtet, dass Zell-Zell-Kontakt MicroR…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HAC war der Milton E. Cassel Gelehrte von der Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Diese Arbeit wurde finanziert durch Zuschüsse zu HAC vom National Institute of General Medical Sciences Center Excellence Grant P50 GM071508 (p.i. David Botstein), PhRMA Foundation Grant 2007RSGl9572, National Science Foundation Grant OCI-1047879, David August, National Institute of General Medical Sciences R01 GM081686, Nationales Institut der allgemeinen medizinischen Wissenschaften R01 GM0866465, die Eli & Edythe breit Zentrum für Regenerative Medizin & Forschung an Stammzellen, die Iris Cantor Frauen Gesundheitszentrum/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, und die Leukämie-Lymphom-Gesellschaft. Forschung berichtet in dieser Publikation wurde von der National Cancer Institute der National Institutes of Health unter Preis Anzahl P50CA092131 unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung. HAC ist Mitglied der Eli & Edythe breite Zentrum für Regenerationsmedizin & Stem Cell Research, dem UCLA-Molekularbiologie-Institut und der UCLA Bioinformatik ressortübergreifenden Programm.
Materials
| Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4°C | |||
| Equipment for running agarose gels | |||
| Sterile tissue culture plates and conical tubes | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-118 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 35-010-CV | |
| Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture | |||
| Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis | |||
| Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples | |||
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | For decontaminating work surfaces from RNase |
| 2.0 ml eppendorf tubes | |||
| Trypsin-EDTA Solution 10X | Millipore Sigma | 9002-07-07 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Actinomycin D | Millipore Sigma | A1410-2 mg | inhibits transcription |
| Sterile DMSO | Fisher Scientific | 31-761-00ML | solvent for actinomycin D |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | ICN19400225 | MP Biomedicals, Inc product |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618500 | molecular biology grade |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | molecular biology grade |
| RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution) | Thermo Fisher Scientific | R0551 | carrier for RNA precipitation |
| TURBO DNA-free Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1907 | removes DNA with DNase, then, in a subsequent step, inactivates DNA and removes divalent cations |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | ICN820721 | MP Biomedicals, Inc product |
| Loading dye for RNA gel | Thermo Fisher Scientific | R0641 | suitable even for denaturing electrophoresis |
| Millenium RNA markers | Thermo Fisher Scientific | AM7150 | RNA ladder |
| One-color RNA Spike-in Kit | Agilent Technology | 5188-5282 | Example spike-in control for Agient microarray analysis |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | molecular biology grade, for TAE buffer |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | for TAE buffer |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | electrophoresis grade, for gels |
| Ethidium bromide | Millipore Sigma | E7637 | for molecular biology |
| External RNA Controls Consortium RNA Spike-in Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | Spike-in control for RNA Seq |
| TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes) | Illumina | RS-122-2101 | for RNA Seq |
| 96-well 0.3 ml PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB-0600 | for real-time qPCR |
| Microseal B adhesive seals | Bio-Rad | MSB1001 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Reagent Reservoirs | VWR | 89094-662 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Eight tube strips and caps | Thermo Fisher Scientific | AM12230 | for real-time qPCR |
| SuperScript Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | for real-time qPCR |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | for real-time qPCR |
References
- Neff, A. T., Lee, J. Y., Wilusz, J., Tian, B., Wilusz, C. J. Global analysis reveals multiple pathways for unique regulation of mRNA decay in induced pluripotent stem cells. Genome Res. 22 (8), 1457-1467 (2012).
- Raghavan, A., Ogilvie, R. L., Reilly, C., Abelson, M. L., Raghavan, S., Vasdewani, J., Krathwohl, M., Bohjanen, P. R. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30 (24), 5529-5538 (2002).
- Cheadle, C., Fan, J., Cho-Chung, Y. S., Werner, T., Ray, J., Do, L., Gorospe, M., Becker, K. G. Control of gene expression during T cell activation: alternate regulation of mRNA transcription and mRNA stability. BMC Genomics. 6, 75 (2005).
- Yang, E., van Nimwegen, E., Zavolan, M., Rajewsky, N., Schroeder, M., Magnasco, M., Darnell, J. E. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13 (8), 1863-1872 (2003).
- Hao, S., Baltimore, D. The stability of mRNA influences the temporal order of the induction of genes encoding inflammatory molecules. Nat Immunol. 10 (3), 281-288 (2009).
- Coller, H. A., Sang, L., Roberts, J. M. A new description of cellular quiescence. PLoS Biol. 4 (3), 83 (2006).
- Wilusz, C. J., Wormington, M., Peltz, S. W. The cap-to-tail guide to mRNA turnover. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (4), 237-246 (2001).
- Garneau, N. L., Wilusz, J., Wilusz, C. J. The highways and byways of mRNA decay. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 113-126 (2007).
- Suh, E. J., Remillard, M. Y., Legesse-Miller, A., Johnson, E. L., Lemons, J. M., Chapman, T. R., Forman, J. J., Kojima, M., Silberman, E. S., Coller, H. A. A microRNA network regulates proliferative timing and extracellular matrix synthesis during cellular quiescence in fibroblasts. Genome Biol. 13 (12), 121 (2012).
- Hoen, P. A., Hirsch, M., de Meijer, E. J., de Menezes, R. X., van Ommen, G. J., den Dunnen, J. T. mRNA degradation controls differentiation state-dependent differences in transcript and splice variant abundance. Nucleic Acids Res. 39 (2), 556-566 (2011).
- Sharova, L. V., Sharov, A. A., Nedorezov, T., Piao, Y., Shaik, N., Ko, M. S. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16 (1), 45-58 (2009).
- Johnson, E. L., Robinson, D. G., Coller, H. A. Widespread changes in mRNA stability contribute to quiescence-specific gene expression patterns in a fibroblast model of quiescence. BMC Genomics. 18 (1), 123 (2017).
- Legesse-Miller, A., Elemento, O., Pfau, S. J., Forman, J. J., Tavazoie, S., Coller, H. A. let-7 Overexpression leads to an increased fraction of cells in G2/M, direct down-regulation of Cdc34, and stabilization of Wee1 kinase in primary fibroblasts. J Biol Chem. 284 (11), 6605-6609 (2009).
- Jiang, L., Schlesinger, F., Davis, C. A., Zhang, Y., Li, R., Salit, M., Gingeras, T. R., Oliver, B. Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments. Genome Res. 21 (9), 1543-1551 (2011).
- Tan, P. K., Downey, T. J., Spitznagel, E. L., Xu, P., Fu, D., Dimitrov, D. S., Lempicki, R. A., Raaka, B. M., Cam, M. C. Evaluation of gene expression measurements from commercial microarray platforms. Nucleic Acids Res. 31 (19), 5676-5684 (2003).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Anders, S., Reyes, A., Huber, W. Detecting differential usage of exons from RNA-seq data. Genome Res. 22 (10), 2008-2017 (2012).
- Vandenbroucke, I. I., Vandesompele, J., Paepe, A. D., Messiaen, L. Quantification of splice variants using real-time PCR. Nucleic Acids Res. 29 (13), 68-68 (2001).
- Hargrove, J. L., Hulsey, M. G., Beale, E. G. The kinetics of mammalian gene expression. Bioessays. 13 (12), 667-674 (1991).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B. 57, 289-300 (1995).
- Hwang, H. W., Wentzel, E. A., Mendell, J. T. Cell-cell contact globally activates microRNA biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7016-7021 (2009).
- Friedel, C. C., Dolken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37 (17), 115 (2009).
- Soeiro, R., Amos, H. mRNA half-life measured by use of actinomycin D in animal cells – A caution. Biochimica et Biophysica Acta. 129 (2), 406-409 (1966).
- Perez-Ortin, J. E., Alepuz, P., Chavez, S., Choder, M. Eukaryotic mRNA decay: methodologies, pathways, and links to other stages of gene expression. J Mol Biol. 425 (20), 3750-3775 (2013).
- Chen, C. Y., Ezzeddine, N., Shyu, A. B. Messenger RNA half-life measurements in mammalian cells. Methods Enzymol. 448, 335-357 (2008).
- Gupta, I., Clauder-Munster, S., Klaus, B., Jarvelin, A. I., Aiyar, R. S., Benes, V., Wilkening, S., Huber, W., Pelechano, V., Steinmetz, L. M. Alternative polyadenylation diversifies post-transcriptional regulation by selective RNA-protein interactions. Mol Syst Biol. 10, 719 (2014).
- Geisberg, J. V., Moqtaderi, Z., Fan, X., Ozsolak, F., Struhl, K. Global analysis of mRNA isoform half-lives reveals stabilizing and destabilizing elements in yeast. Cell. 156 (4), 812-824 (2014).
- Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Mol Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
- Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nat Biotechnol. 23 (2), 232-237 (2005).
- Rabani, M., Levin, J. Z., Fan, L., Adiconis, X., Raychowdhury, R., Garber, M., Gnirke, A., Nusbaum, C., Hacohen, N., Friedman, N., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).
- Marzi, M. J., Ghini, F., Cerruti, B., de Pretis, S., Bonetti, P., Giacomelli, C., Gorski, M. M., Kress, T., Pelizzola, M., Muller, H., et al. Degradation dynamics of microRNAs revealed by a novel pulse-chase approach. Genome Res. 26 (4), 554-565 (2016).
