Un Multimodal Imaging approccio basato su Micro-CT e fluorescenza molecolare tomografia per valutazione longitudinale della fibrosi polmonare indotta da bleomicina in topi
Summary
Descriviamo un multimodali non invasive imaging approccio basato su Micro-CT e fluorescenza molecolare tomografia per valutazione longitudinale del modello di fibrosi del polmone del topo indotto mediante instillazione intratracheale doppia di bleomicina.
Abstract
Fibrosi polmonare idiopatica (IPF) è una malattia polmonare mortale caratterizzata dalla distruzione progressiva e irreversibile dell’architettura polmonare, che provoca il deterioramento significativo nella funzione polmonare e la successiva morte da guasto respiratorio.
La patogenesi della IPF in modelli sperimentali animali è stata indotta tramite la somministrazione di bleomicina. In questo studio, indaghiamo su un modello di topo IPF-come indotto da un’instillazione di bleomicina endotracheale doppia. Valutazioni istologiche standard usate per lo studio della fibrosi polmonare sono procedure invasive terminale. L’obiettivo di questo lavoro è quello di monitorare la fibrosi polmonare attraverso tecniche di imaging non invasive come tomografia molecolare fluorescente (FMT) e Micro-CT. Queste due tecnologie convalidate con i risultati di istologia potrebbero rappresentare un rivoluzionario approccio funzionale per tempo reale il monitoraggio non invasivo della progressione e della severità di malattia IPF. La fusione di diversi approcci rappresenta un ulteriore passo avanti per la comprensione della malattia IPF, dove gli eventi molecolari che si verificano in una condizione patologica possono essere osservati con FMT e i successivi cambiamenti anatomici possono essere monitorati da Micro-CT.
Introduction
Fibrosi polmonare idiopatica (IPF) è l’affezione polmonare cronica con progressiva diminuzione delle funzioni polmonari che purtroppo è spesso fatale entro quattro anni dalla diagnosi1. Le caratteristiche principali di IPF sono deposizione di matrice extracellulare e la proliferazione dei fibroblasti, ma la patogenesi non è ancora pienamente compreso. L’ipotesi più sostenuto è che i cicli multipli di lesioni polmonari causano la distruzione delle cellule epiteliali alveolari che conduce alla alterazione della proliferazione ciclo delle cellule mesenchimali, esagerato accumulo di fibroblasti e miofibroblasti, e produzione aumentata della matrice. Mediatori coinvolti in questi processi come metalloproteinasi della matrice (MMPs) sono stati trovati dysregulated nello sviluppo di fibrosi IPF umano o in modelli animali indotta da bleomicina. La produzione di MMP incontrollata conduce ad una deposizione di collagene sbilanciato all’interno dell’interstizio del polmone e dello spazio alveolare, imitante la ferita anormale riparazione1,2.
Uno dei principali ostacoli per drogare scoperta e sviluppo è la disponibilità di modelli murini accessibile che imitano la patogenesi umana e il fenotipo della malattia. Diversi agenti sono stati usati per indurre fibrosi polmonare in modelli animali: danni di irradiazione, la somministrazione di amianto e silice, somministrazione di citochine fibrinogenic e bleomicina3,4; Tuttavia la bleomicina è il più usato in topi, ratti, cavie, criceti, conigli5 o in animali di grossa taglia (primati non umani, cavalli, cani e ruminanti)6,7. Bleomicina è un antibiotico fatto dal batterio Streptomyces verticillus8 e viene utilizzato come un agente anti-cancro9. La fibrosi polmonare è un comune effetto collaterale del farmaco e per questo motivo, è usato nei modelli animali sperimentali per indurre fibrosi polmonare.
Nei modelli di fibrosi polmonare indotta da bleomicina, le lesioni fibrotiche verificano 14-21 giorni dopo la somministrazione di bleomicina. Nei lavori presentati, abbiamo usato un nuovo protocollo per indurre fibrosi polmonare in topi mediante instillazione intratracheale doppia bleomicina. Modello del topo di bleomicina è richiede molto tempo perché i nuovi farmaci devono essere valutati su lesioni fibrotiche stabilite e testato per distinguere i loro effetti anti-fibrotici da effetti antinfiammatori.
Biochimici determinazione del contenuto di collagene, morphometrical e analisi istologica erano basati su analisi di post mortem, limitando la possibilità di seguire la patogenesi della malattia nello stesso animale. Anche se questi parametri sono stati considerati un gold standard per la valutazione della fibrosi, non fornire qualsiasi distribuzione temporale o spaziale della lesione fibrotica e precludono un modo per indagare il processo di progressione di malattia. 10
Recentemente, sono state applicate tecnologie di imaging non invasivo monitor vie respiratorie che ritoccano, infiammazione e progressione della fibrosi in modelli murini: Imaging a risonanza magnetica (MRI), tomografia del calcolatore Micro (Micro-CT), fluorescenza molecolare Tomografia (FMT) e bioluminescenti (BLI)11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21. Noi proponiamo un approccio di imaging non invasivo per monitorare longitudinalmente la progressione della fibrosi polmonare da FMT e Micro-CT a diversi intervalli di tempo dopo un bleomicina sfida22.
Molte vie sono coinvolti nella creazione e sviluppo di fibrosi, e non si sa molto. Solo una più profonda comprensione di questi processi potrebbe tradurre a più bersagli farmacologici che possono trasferire in clinica. La possibilità di monitorare longitudinalmente l’attivazione MMP tramite tomografia molecolare fluorescenza accoppiata alla rilevazione di cambiamenti parenchimatica del polmone da Micro-CT potrebbe essere utilizzata in futuro per accedere la risposta clinica al trattamento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nonostante molti gruppi di ricerca incentrati sullo sviluppo di nuovi farmaci per il trattamento di IPF, al momento solo due sono disponibili per i pazienti. C’è un urgente bisogno di mediche per trovare più efficaci terapie7 perché solo polmone transplantationis in grado di prolungare la sopravvivenza di 4-5 anni26. Prerequisito essenziale per la medicina traslazionale e lo sviluppo di nuovi farmaci è la disponibilità di un modello animale che imita le caratteristiche…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrei ringraziare Dr. Daniela Pompilio e Roberta Ciccimarra per assistenza tecnica.
Materials
| FMT 2500 Fluorescence Tomography System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| MMPsense 680 | Perkin Elmer Inc. | NEV10126 | Protect from light, store the probe at 4 °C |
| TrueQuant software | Perkin Elmer Inc. | ||
| Female inbred C57BL/6 | San Pietro NatisoneHorst, The Netherlands (UD), | Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions | |
| Isoflurane | ESTEVE spa | 571329.8 | Do not inhale |
| Automated cell counter | Dasit XT 1800J | Experimental Builder | |
| Saline Solution, 0.9% Sodium Chloride (NaCl) | Eurospital | 15A2807 | |
| Quantum FX Micro-CT scanner | Perkin Elmer Inc. | ||
| Bleomycin sulphate from Streptomyces Verticillus | Sigma | B2434 | |
| Automatic tissue Processor | ATP700 Histo-Line Laboratories | ATP700 | |
| Embedding system | EG 1160 Leica Biosystems | EG 1160 | |
| Rotary microtome | Slee Cut 6062 | ||
| Digital slide scanner | NanoZoomer S60, Hamamatsu Photonics | ||
| NIS-AR image analysis software | Nikon | ||
| Masson’s Trichrome Staining | Histo-Line Laboratories | ||
| 10% neutral-buffered formalin | Sigma | HT5012-1CS | |
| Penn-century model DP-4M Dry power insufflator | Penn-century | DPM-EXT | |
| PE190 micro medical tubing | 2biological instruments snc | BB31695-PE/8 | |
| Syringe without needle 5 mL | Terumo | SS*05SE1 | Cut the boards of the piston by scissors |
| Hamilton 0.10 mL (model 1710) | Gastight | 81022 | |
| Discofix 3-way Stopcock | Braun | 4095111 | |
| Syringe with needle 1 mL | Pic solution | 3,071,260,300,320 | Use without needle |
| Plastic feeding tubes 18 ga x 50 mm | 2biological instruments snc | FTP-18-50 | Cut obliquely the tip |
References
- Wynn, T. A. Integrating mechanisms of pulmonary fibrosis. J. Exp. Med. 208 (7), 1339-1350 (2011).
- Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nat. Med. 18 (7), 1028-1040 (2012).
- Moore, B. B. Animal models of fibrotic lung disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (2), 167-179 (2013).
- Ackermann, M., et al. Effects of nintedanib on the microvascular architecture in a lung fibrosis model. Angiogenesis. , (2017).
- Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294 (2), 152-160 (2008).
- Organ, L., et al. A novel segmental challenge model for bleomycin-induced pulmonary fibrosis in sheep. Exp Lung Res. 41 (3), 115-134 (2015).
- Organ, L., et al. Structural and functional correlations in a large animal model of bleomycin-induced pulmonary fibrosis. BMC Pulm Med. 15, 81 (2015).
- Shen, B., Du, L., Sanchez, C., Edwards, D. J., Chen, M., Murrell, J. M. Cloning and characterization of the bleomycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces verticillus ATCC15003. J Nat Prod. 65 (3), 422-431 (2002).
- Yu, Z., et al. Targeted Delivery of Bleomycin: A Comprehensive Anticancer Review. Curr Cancer Drug Targets. 16 (6), 509-521 (2016).
- Ashcroft, T., Simpson, J. M., Timbrell, V. Simple method of estimating severity of pulmonary fibrosis on a numerical scale. J Clin Pathol. 41 (4), 467-470 (1988).
- Stellari, F., et al. In vivo imaging of the lung inflammatory response to Pseudomonas aeruginosa and its modulation by azithromycin. J Transl Med. 13, 251 (2015).
- Stellari, F., et al. In vivo monitoring of lung inflammation in CFTR-deficient mice. J Transl Med. 14 (1), 226 (2016).
- Stellari, F. F., et al. In vivo imaging of transiently transgenized mice with a bovine interleukin 8 (CXCL8) promoter/luciferase reporter construct. PloS one. 7 (6), 39716 (2012).
- Stellari, F. F., et al. Enlightened Mannhemia haemolytica lung inflammation in bovinized mice. Vet Res. 45, 8 (2014).
- Tassali, N., et al. MR imaging, targeting and characterization of pulmonary fibrosis using intra-tracheal administration of gadolinium-based nanoparticles. Contrast Media Mol Imaging. 11 (5), 396-404 (2016).
- Ma, X., et al. Assessment of asthmatic inflammation using hybrid fluorescence molecular tomography-x-ray computed tomography. J Biomed Opt. 21 (1), 15009 (2016).
- Van de Velde, G., et al. Longitudinal micro-CT provides biomarkers of lung disease that can be used to assess the effect of therapy in preclinical mouse models, and reveal compensatory changes in lung volume. Dis Model Mech. 9 (1), 91-98 (2016).
- Stellari, F. F., et al. Heterologous Matrix Metalloproteinase Gene Promoter Activity Allows In Vivo Real-time Imaging of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Transiently Transgenized Mice. Front Immunol. 8, 199 (2017).
- Hellbach, K., et al. X-ray dark-field radiography facilitates the diagnosis of pulmonary fibrosis in a mouse model. Sci Rep. 7 (1), 340 (2017).
- Zhou, Y., et al. Noninvasive imaging of experimental lung fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol. 53 (1), 8-13 (2015).
- Ruscitti, F., et al. Longitudinal assessment of bleomycin-induced lung fibrosis by Micro-CT correlates with histological evaluation in mice. Multidiscip Respir Med. 12, 8 (2017).
- Stellari, F., et al. Monitoring inflammation and airway remodeling by fluorescence molecular tomography in a chronic asthma model. J Transl Med. 13, 336 (2015).
- . . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th ed. , (2011).
- Meganck, J. A., Liu, B. Dosimetry in Micro-computed Tomography: a Review of the Measurement Methods, Impacts, and Characterization of the Quantum GX Imaging System. Mol Imaging Biol. , (2016).
- Hubner, R. H., et al. Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples). BioTechniques. 44 (4), 507-514 (2008).
- King, T. E., Pardo, A., Selman, M. Idiopathic pulmonary fibrosis. Lancet. 378 (9807), 1949-1961 (2011).
- De Langhe, E., et al. Quantification of lung fibrosis and emphysema in mice using automated micro-computed tomography. PloS one. 7 (8), 43123 (2012).
