Eksempel forberedelse og bildebehandling for Exosomes av overføring elektronmikroskop
Summary
Denne protokollen beskriver ulike teknikker nødvendig for overføring elektronmikroskop inkludert negative flekker, supertynn snitting for detaljert struktur og immun-gull merking for å bestemme plasseringen av spesifikke proteiner i exosomes.
Abstract
Exosomes er nano-størrelse ekstracellulære blemmer utskilles av kroppsvæsker, og er kjent som representerer egenskapene til celler det avsondre dem. Innholdet og morfologi av secreted blemmer gjenspeile cellen atferd eller fysiologiske status, for eksempel cellevekst, migrasjon, cleavage og død. Exosomes’ rolle kan svært avhengig av størrelse og størrelsen på exosomes varierer fra 30 til 300 nm. Den mest brukte metoden for exosome imaging er negativ flekker, mens andre resultater er basert på Cryo-overføring elektronmikroskop og skanning elektronmikroskop Atomic Force mikroskopi. Den typiske exosome morfologi vurdert gjennom negative flekker er en kopp-form, men ytterligere detaljer er ikke ennå klar. En exosome godt karakterisert gjennom strukturelle studien er nødvendig spesielt i medisinske og farmasøytiske. Derfor må funksjon-avhengige morfologi verifiseres av elektronmikroskop teknikker som merking et bestemt protein i detaljert strukturen i exosome. For å observere detaljert struktur, ble supertynn valgte bilder og negative farget bilder av exosomes sammenlignet. I denne protokollen foreslår vi overføring elektronmikroskop for avbilding av exosomes inkludert negative flekker, hele mount immuno-flekk, blokk forberedelse, tynne delen og immun-gull merking.
Introduction
Ekstracellulære blemmer (EVs) er lipid bilayer blemmer utskilles av celler, og deres størrelse varierer mellom 30 og 300 nm. EVs ble først rapportert i 1978 med bevis fra blemmer av pasienter med Hodgkins sykdom1. Disse vesikler ble rapportert å være 40 til 120 nanometer i størrelse. I 1980 ble det rapportert at EVs er involvert i koagulasjonssystemet og blodpropp, dannelse av blodpropp i en blodåre i kreft pasienter2. Etter 30 år, er EVs rapportert å være en viktig faktor å fremme svulst invasjon, immun rømme og angiogenese3. Dessuten, har funksjonene til EVs studert som regulatorer i mobilnettet interaksjoner i områder av betennelse, immune disorder, nevrologisk sykdom og kreft4. Siden EVs inneholder bestemte biomolecules som protein, mRNA og microRNA5, har deres potensielle programmet i diagnostikk og therapeutics vært analysert6,7. EVs er en kategori består av undergrupper inkludert exosomes, prostasomes, oncosomes, dexosomes, microparticles, promininosomes, argosomes og exosome som blemmer, avhengig av mobilnettet opprinnelse og biologisk funksjon3. I tillegg kan basert på deres biogenesis, disse EVs deles inn i microvesicles (skur microvesicles, 100-1000 nm) og exosomes (30-300 nm)8,9. Blant disse, har exosome blitt rapportert som en celle kommunikator for immunforsvaret10, kreft11,12og smittsomme sykdommer13.
Interesse i exosomes som en biomarkør for tidlig diagnostisering øker raskt, og rensing og karakterisering av exosomes må ledsages med molekylær Bildeteknikker. Ulik størrelse og morphologies av exosomes, avhengig av deres opprinnelse og funksjonen14, kan være preget av mikroskopi teknikker med høy oppløsning, for eksempel elektronmikroskop. De fleste exosomes var visualisert ved negative farget overføring elektronmikroskop (TEM)15,16,17, og disse resultatene ble bekreftet av immunolabeling av et bestemt protein i hele mount vesicle 18. flere forskningsgrupper har rapportert strukturen gjennom skanning elektronmikroskop, Atomic Force mikroskopi19,20og Cryo-TEM21,22. Men mens disse teknikkene er nyttige for å studere exosome strukturen, er de ikke nok for å observere plasseringen av spesifikke proteiner ligger inne på exosome. Derfor innført vi en protokoll for imaging exosomes med et bestemt protein merking. Vi brukt blokk forberedelse, supertynn snitting og immunostai-for konstatere protein’s detaljert beliggenhet i exosome. Dette ble sammenlignet med negative flekker og hele mount immunostai-, som tradisjonelt brukes for karakteristikk av exosome.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne artikkelen presenterer en protokoll for å observere det detaljert exosome struktur og merking av sine spesifikke proteiner. Negativ flekker har vært ansett som den beste metoden for exosome imaging17. Denne konvensjonelle teknikken vist exosomes’ cup-formet struktur. Men er denne kopp form en form for gjenstanden som kan skyldes tørkeprosessen. Cryo-TEM resultatene har vist at exosomes har en perfekt sfærisk struktur i vandig løsning25,<sup class="xref…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble støttet av Bio & medisinsk teknologi Development Program av National Research Foundation (NRF) & finansiert av koreanske myndigheter (MSIP & MOHW) (nr. 2016M3A9B6904244). Vi takker også medlemmer av Medisintran Bioconvergence Research Center for rensing av exosome.
Materials
| Glutaraldehyde | EMS | 16200 | |
| Sodium cacodylate | EMS | 12300 | |
| Osmium tetroxide 1 g crystal | EMS | 19100 | Use only in fume hood |
| acetone | JUNSEI | 1B2031 | |
| Spurr medium | TED PELLA | 18108 | |
| Ultra-microtome | Leica | UCT | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Hazardous chemical |
| Lead citrate | EMS | 17900 | |
| Transmission Electron Microscopy | Hitachi | H7600 | |
| nickel grid | EMS | G200-Ni | |
| Copper grid | EMS | G200-Cu | |
| glycine | SIGMA | 022K5404 | |
| Phosphate buffer saline | SIGMA | P4417 | |
| Bovine serum albumin | Aurion | 25557 | |
| 1st Antibody | purification in manually | ||
| Purified anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) Antibody | BioLegend | 329710 | Whole mount Immumogold |
| Purified Mouse IgG2b, κ Isotype Ctrl | BioLegend | 401202 | Whole mount Immumogold (Control) |
| 2nd Anti-mouse igG conjugated 9-11 nm gold particle | sigma | G7652 | |
| silver paint | CANS | CTP100 | |
| aluminum stub | EMS | 75622 | |
| FIB-SEM | Zeiss | AURIGA | |
| Transmission Electron Microscopy | JEOL | JEM2200FS | |
| Glow discharger | JEOL | JFC1100E | |
| Carbon grid | EMS | 121119 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19210 | |
| Formvar carbon coated Copper Grid (200 meh) | EMS | FCF200-CU | |
| Formvar carbon coated Nickel Grid (200 mesh) | EMS | FCF200-NI |
References
- Friend, C., et al. Observations on cell lines derived from a patient with Hodgkin’s disease. Cancer Res. 38 (8), 2581-2591 (1978).
- Dvorak, H. F., et al. Tumor shedding and coagulation. Science. 212 (4497), 923-924 (1981).
- Zaborowski, M. P., Balaj, L., Breakefield, X. O., Lai, C. P. Extracellular Vesicles: Composition, Biological Relevance, and Methods of Study. Bioscience. 65 (8), 783-797 (2015).
- Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066 (2015).
- Wu, Y., Deng, W., Klinke, D. J. Exosomes: improved methods to characterize their morphology, RNA content, and surface protein biomarkers. Analyst. 140 (19), 6631-6642 (2015).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacol Ther. , (2017).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim Biophys Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
- Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutierrez-Vazquez, C., Sanchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: regulation of exosome loading. Semin Cancer Biol. 28, 3-13 (2014).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney Int. 78 (9), 838-848 (2010).
- Zaharie, F., et al. Exosome-Carried microRNA-375 Inhibits Cell Progression and Dissemination via Bcl-2 Blocking in Colon Cancer. J Gastrointestin Liver Dis. 24 (4), 435-443 (2015).
- Fuhrmann, G., Neuer, A. L., Herrmann, I. K. Extracellular vesicles – a promising avenue for the detection and treatment of infectious diseases?. Eur J Pharm Biopharm. , (2017).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Liu, X., Wang, H. W. Single particle electron microscopy reconstruction of the exosome complex using the random conical tilt method. J Vis Exp. (49), (2011).
- Wang, J., Yao, Y., Wu, J., Li, G. Identification and analysis of exosomes secreted from macrophages extracted by different methods. Int J Clin Exp Pathol. 8 (6), 6135-6142 (2015).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , 22 (2006).
- Mazzeo, C., et al. Exosome secretion by eosinophils: A possible role in asthma pathogenesis. J Allergy Clin Immunol. 135 (6), 1603-1613 (2015).
- Sokolova, V., et al. Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 87 (1), 146-150 (2011).
- Sharma, S., et al. Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy. ACS Nano. 4 (4), 1921-1926 (2010).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Sci Rep. 6, 36162 (2016).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Kim, S. B., et al. Caspase-8 controls the secretion of inflammatory lysyl-tRNA synthetase in exosomes from cancer cells. J Cell Biol. , (2017).
- Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. J Proteome Res. 7 (12), 5157-5166 (2008).
- Kadiu, I., Narayanasamy, P., Dash, P. K., Zhang, W., Gendelman, H. E. Biochemical and biologic characterization of exosomes and microvesicles as facilitators of HIV-1 infection in macrophages. J Immunol. 189 (2), 744-754 (2012).
- Gong, J., Korner, R., Gaitanos, L., Klein, R. Exosomes mediate cell contact-independent ephrin-Eph signaling during axon guidance. J Cell Biol. 214 (1), 35-44 (2016).
- Melo, S. A., et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer. Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).
- van Niel, G., Heyman, M. The epithelial cell cytoskeleton and intracellular trafficking. II. Intestinal epithelial cell exosomes: perspectives on their structure and function. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 283 (2), G251-G255 (2002).
