Préparation des échantillons et l’imagerie des Exosomes par microscopie électronique à Transmission
Summary
Ce protocole décrit les différentes techniques nécessaires à la microscopie électronique en transmission dont une coloration négative, coupes ultraminces pour structure détaillée et l’immuno-or étiquetage afin de déterminer les positions des protéines spécifiques dans les exosomes.
Abstract
Exosomes sont de taille nanométrique des vésicules extracellulaires sécrétées par les fluides corporels et sont connus pour représenter les caractéristiques des cellules qui sécrètent les. Le contenu et la morphologie des vésicules sécrétées reflètent le comportement cellulaire ou l’état physiologique, par exemple la croissance cellulaire, migration, clivage et la mort. Rôle des exosomes peut dépendre fortement de taille, et la taille des exosomes varie de 30 à 300 nm. La méthode la plus utilisée pour l’imagerie de l’exosome est une coloration négative, tandis que les autres résultats sont basés sur la microscopie à Force atomique, microscopie électronique à balayage et Cryo-microscopie électronique. Morphologie de l’exosome typique évaluée au moyen d’une coloration négative est une forme de coupe, mais davantage de détails ne sont pas encore claires. L’exosome bien caractérisée par l’étude structurelle est nécessaire notamment dans le domaine médical et pharmaceutique. Par conséquent, morphologie fonction dépendant doit être vérifiée par des techniques de microscopie électronique tels que l’étiquetage d’une protéine spécifique dans la structure détaillée de l’exosome. Pour observer la structure détaillée, images coupes ultraminces et images colorées négatives des exosomes ont été comparés. Dans ce protocole, nous vous suggérons de microscopie électronique à transmission pour l’imagerie des exosomes dont une coloration négative toute monture immunomarquage, préparation de bloc, lame mince et étiquetage immuno-or.
Introduction
Les vésicules extracellulaires (EVs) sont des vésicules de bicouche lipidique sécrétées par les cellules, et leur taille varie entre 30 et 300 nm. EVs ont été pour la première fois en 1978, avec preuve de vésicules des patients atteints de maladie de Hodgkin1. Ces vésicules ont été signalés à être 40 à 120 nanomètres dans la taille. En 1980, il a été signalé que les EVs sont impliqués dans le système de coagulation et de la thrombose, la formation d’un caillot de sang à l’intérieur d’un vaisseau sanguin dans le cancer patients2. Après 30 ans, les EVs ont été signalés à être un facteur important pour promouvoir l’invasion tumorale, évasion immunitaire et angiogenèse3. En outre, les fonctions du serveur virtuel Exchange ont été étudiées comme régulateurs dans les interactions cellulaires dans les domaines de l’inflammation, troubles immunitaires, maladie neurologique et le cancer4. Puisque EVs contiennent des biomolécules spécifiques tels que des protéines, ARNm et des micro-ARN5, leur application potentielle dans le diagnostic et la thérapeutique a été analysé6,7. Véhicules électriques constituent une catégorie composée des sous-groupes dont les exosomes, prostasomes, oncosomes, dexosomes, microparticules, promininosomes, argosomes et vésicules exosome semblable, selon leur origine cellulaire et leur fonction biologique3. En outre, basé sur leur biogenèse, ces EVs peuvent être divisés en microvésicules (hangar microvésicules, 100-1000 nm) et exosomes (30-300 nm)8,9. Parmi ceux-ci, l’exosome a été signalé comme un communicateur cellulaire pour10de la réponse immunitaire, cancer11,12et maladies infectieuses13.
Intérêt pour les exosomes comme biomarqueurs pour diagnostic précoce augmente rapidement, et la purification et la caractérisation des exosomes doivent s’accompagner avec des techniques d’imagerie moléculaires. Les différentes tailles et morphologies des exosomes, selon leur origine et fonction14, se distingués par des techniques de microscopie à haute résolution, telles que la microscopie électronique. La plupart exosomes ont été visualisées par négatifs colorés microscopie électronique à Transmission (TEM)15,16,17, et ces résultats sont confirmés par immunomarquage d’une protéine spécifique dans la vésicule de support entier 18. plusieurs groupes de recherche ont rapporté la structure par microscopie électronique à balayage, microscopie à Force atomique19,20et Cryo-TEM21,22. Cependant, bien que ces techniques sont utiles pour étudier la structure de l’exosome, elles sont insuffisantes pour observer la position des protéines spécifiques situés à l’intérieur de l’exosome. Par conséquent, nous vous présentions un protocole d’imagerie exosomes avec l’étiquetage d’une protéine spécifique. Nous avons appliqué la préparation du bloc, coupes ultraminces et immunostaining pour déterminer l’emplacement détaillé de la protéine dans l’exosome. Cela a été comparé avec une coloration négative et toute monture immunomarquage, qui est traditionnellement utilisée pour la caractérisation de l’exosome.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article présente un protocole pour observer la structure de l’exosome détaillée et le marquage de ses protéines spécifiques. Une coloration négative a été considérée comme la meilleure méthode pour exosome d’imagerie17. Cette technique classique a montré la structure en forme de tasse des exosomes. Cependant, cette forme de coupe est une forme d’artefact qui peut se produire en raison du processus de séchage. Résultats de la Cryo-TEM ont montré que les exosomes ont une str…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par le Bio & Medical Technology Development Program de la National Research Foundation (NRF) & financé par le gouvernement coréen (MSIP & Ministère) (n° 2016M3A9B6904244). Nous remercions également les membres du pôle de recherche Bioconvergence médicinales pour la purification de l’exosome.
Materials
| Glutaraldehyde | EMS | 16200 | |
| Sodium cacodylate | EMS | 12300 | |
| Osmium tetroxide 1 g crystal | EMS | 19100 | Use only in fume hood |
| acetone | JUNSEI | 1B2031 | |
| Spurr medium | TED PELLA | 18108 | |
| Ultra-microtome | Leica | UCT | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Hazardous chemical |
| Lead citrate | EMS | 17900 | |
| Transmission Electron Microscopy | Hitachi | H7600 | |
| nickel grid | EMS | G200-Ni | |
| Copper grid | EMS | G200-Cu | |
| glycine | SIGMA | 022K5404 | |
| Phosphate buffer saline | SIGMA | P4417 | |
| Bovine serum albumin | Aurion | 25557 | |
| 1st Antibody | purification in manually | ||
| Purified anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) Antibody | BioLegend | 329710 | Whole mount Immumogold |
| Purified Mouse IgG2b, κ Isotype Ctrl | BioLegend | 401202 | Whole mount Immumogold (Control) |
| 2nd Anti-mouse igG conjugated 9-11 nm gold particle | sigma | G7652 | |
| silver paint | CANS | CTP100 | |
| aluminum stub | EMS | 75622 | |
| FIB-SEM | Zeiss | AURIGA | |
| Transmission Electron Microscopy | JEOL | JEM2200FS | |
| Glow discharger | JEOL | JFC1100E | |
| Carbon grid | EMS | 121119 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19210 | |
| Formvar carbon coated Copper Grid (200 meh) | EMS | FCF200-CU | |
| Formvar carbon coated Nickel Grid (200 mesh) | EMS | FCF200-NI |
References
- Friend, C., et al. Observations on cell lines derived from a patient with Hodgkin’s disease. Cancer Res. 38 (8), 2581-2591 (1978).
- Dvorak, H. F., et al. Tumor shedding and coagulation. Science. 212 (4497), 923-924 (1981).
- Zaborowski, M. P., Balaj, L., Breakefield, X. O., Lai, C. P. Extracellular Vesicles: Composition, Biological Relevance, and Methods of Study. Bioscience. 65 (8), 783-797 (2015).
- Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066 (2015).
- Wu, Y., Deng, W., Klinke, D. J. Exosomes: improved methods to characterize their morphology, RNA content, and surface protein biomarkers. Analyst. 140 (19), 6631-6642 (2015).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacol Ther. , (2017).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim Biophys Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
- Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutierrez-Vazquez, C., Sanchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: regulation of exosome loading. Semin Cancer Biol. 28, 3-13 (2014).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney Int. 78 (9), 838-848 (2010).
- Zaharie, F., et al. Exosome-Carried microRNA-375 Inhibits Cell Progression and Dissemination via Bcl-2 Blocking in Colon Cancer. J Gastrointestin Liver Dis. 24 (4), 435-443 (2015).
- Fuhrmann, G., Neuer, A. L., Herrmann, I. K. Extracellular vesicles – a promising avenue for the detection and treatment of infectious diseases?. Eur J Pharm Biopharm. , (2017).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Liu, X., Wang, H. W. Single particle electron microscopy reconstruction of the exosome complex using the random conical tilt method. J Vis Exp. (49), (2011).
- Wang, J., Yao, Y., Wu, J., Li, G. Identification and analysis of exosomes secreted from macrophages extracted by different methods. Int J Clin Exp Pathol. 8 (6), 6135-6142 (2015).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , 22 (2006).
- Mazzeo, C., et al. Exosome secretion by eosinophils: A possible role in asthma pathogenesis. J Allergy Clin Immunol. 135 (6), 1603-1613 (2015).
- Sokolova, V., et al. Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 87 (1), 146-150 (2011).
- Sharma, S., et al. Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy. ACS Nano. 4 (4), 1921-1926 (2010).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Sci Rep. 6, 36162 (2016).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Kim, S. B., et al. Caspase-8 controls the secretion of inflammatory lysyl-tRNA synthetase in exosomes from cancer cells. J Cell Biol. , (2017).
- Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. J Proteome Res. 7 (12), 5157-5166 (2008).
- Kadiu, I., Narayanasamy, P., Dash, P. K., Zhang, W., Gendelman, H. E. Biochemical and biologic characterization of exosomes and microvesicles as facilitators of HIV-1 infection in macrophages. J Immunol. 189 (2), 744-754 (2012).
- Gong, J., Korner, R., Gaitanos, L., Klein, R. Exosomes mediate cell contact-independent ephrin-Eph signaling during axon guidance. J Cell Biol. 214 (1), 35-44 (2016).
- Melo, S. A., et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer. Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).
- van Niel, G., Heyman, M. The epithelial cell cytoskeleton and intracellular trafficking. II. Intestinal epithelial cell exosomes: perspectives on their structure and function. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 283 (2), G251-G255 (2002).
