Métodos para analisar os impactos de urânio Natural em In Vitro Osteoclastogenesis
Summary
Urânio é conhecido por afetar o metabolismo ósseo. Aqui, apresentamos um protocolo que visa investigar o efeito da exposição de urânio natural sobre a viabilidade, a diferenciação e a função dos osteoclastos, as células responsável pela reabsorção óssea.
Abstract
Urânio foi mostrado para interferir na fisiologia óssea e está bem estabelecido que este metal se acumula no osso. No entanto, pouco é conhecido sobre o efeito do urânio natural sobre o comportamento de células ósseas. Em particular, o impacto de urânio em osteoclastos, as células responsáveis pela reabsorção da matriz óssea, não está documentado. Para investigar esse problema, nós estabelecemos um novo protocolo usando acetato de uranilo como uma fonte de urânio natural e a linha de celular murino 264.7 crus como um modelo de precursores do osteoclast. Neste documento, nós detalhados todos os ensaios necessários para testar a citotoxidade de urânio sobre precursores osteoclasto e avaliar o seu impacto sobre a osteoclastogenesis e a função resorbing dos osteoclastos maduros. As condições que nós desenvolvemos, em particular para a preparação de uranilo, contendo meios de cultura e para a semeadura de RAW 264.7 células permitem para obter resultados confiáveis e altamente reprodutivos. Além disso, otimizamos o uso de ferramentas de software para facilitar a análise de vários parâmetros como o tamanho dos osteoclastos ou a porcentagem de matriz reabsorvido.
Introduction
Urânio é um elemento radioativo ocorre naturalmente presente no solo, ar e água; como tal, animais e seres humanos estão expostos ao urânio natural em suas dietas. Além de fontes naturais, urânio origina actividades antropogénicas, que aumenta a sua abundância no ambiente. Urânio representa perigos químicos e radiológicos. No entanto, porque o urânio natural (que é uma mistura isotópica contendo 99.27% 238U, 0.72% 235U e 0.006% 234U) tem uma baixa atividade específica (25.103 Bq.g-1), seus impactos na saúde são atribuídos à sua toxicidade química.
O que quer que sua rota de entrada (inalação, ingestão ou exposição dérmica), a maioria de urânio, entrando no corpo é eliminado com fezes e apenas uma pequena porção atinge a circulação sistêmica. Cerca de 67% do urânio no sangue, por sua vez é filtrada pelos rins e deixa o corpo na urina dentro de 24 h1. O restante é depositado principalmente nos rins e ossos, os dois órgãos-alvo principal de urânio toxicidade2,3,4. Porque o esqueleto foi identificado como o local principal de urânio de retenção do longo prazo2,3,4,5,6, vários estudos têm sido realizados para explorar o efeito de urânio no osso fisiologia7.
Osso é um tecido mineralizado que é continuamente remodelado durante toda sua vida. Remodelação óssea é um processo complexo que depende de tipos de células especializadas e consiste principalmente em duas fases: reabsorção da matriz antiga pré-existente pelos osteoclastos, seguido por construção de osso de novo pelos osteoblastos. Osteoclastos são células grandes Relaxometria, resultando da fusão de células precursoras de origem hematopoiética que migram para locais de reabsorção, onde eles atribuem ao osso8. Sua fixação ocorre simultaneamente com uma extensa reorganização do seu citoesqueleto9. Esta reorganização é necessária para o estabelecimento de um compartimento isolado entre a célula e superfície óssea no qual o osteoclasto segrega prótons, levando à dissolução da hidroxiapatita e proteases envolvidas na degradação da matriz orgânica. Os produtos resultantes da degradação são endocytosed, transportado através da célula para a área de membrana oposta à superfície óssea e secretada, um processo chamado transcytosis10,11.
Resultados de estudos in vivo e in vitro indicam que o urânio inibe a formação óssea e altera o número e a atividade dos osteoblastos7,12. Em contraste, os efeitos do urânio na reabsorção óssea e osteoclastos têm sido mal explorados. Várias em vivo estudos relataram um aumento da reabsorção óssea após a administração de nitrato de uranilo para ratos ou ratos de13,14. Além disso, uma investigação epidemiológica sugere que o aumento na ingestão de urânio através da água potável tendeu a ser associado com um aumento do nível de soro de um marcador de reabsorção óssea em homens15. Tomados em conjunto, estas descobertas levaram à conclusão de que o urânio, que se acumula no osso poderia promover reabsorção óssea. No entanto, os mecanismos celulares envolvidos neste efeito potencial de urânio permanecem uma questão em aberto. Por esta razão, decidimos analisar o impacto de urânio no comportamento de resorbing células ósseas.
Aqui, descrevemos o protocolo que estabelecemos para caracterizar e quantificar os efeitos do urânio natural na viabilidade de pre-osteoclastos e na diferenciação de osteoclastos e atividade Odontoclastic. Os experimentos descritos neste documento tem sido feitos com a linha de celular de murino macrófago transformado 264.7 crus, que facilmente pode se diferenciar em osteoclastos quando cultivadas na presença da citocina RANKL por 4 ou 5 dias, e que é classicamente usado para estudar osteoclast diferenciação e função16. Os procedimentos desenvolvidos são confiáveis, dá resultados altamente reprodutíveis e são plenamente aplicável aos osteoclastos primários. Por todas estas razões, acreditamos que essa metodologia é útil para obter uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na toxicidade de urânio no osso. Além disso, pensamos que esta abordagem poderia ser adaptada como uma ferramenta de triagem para identificar o urânio novo agentes quelantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tanto quanto sabemos, esta é a primeira vez que um procedimento detalhado com o objetivo de estudar os efeitos do urânio natural no osso resorbing células é descrito. Esta abordagem será útil para alcançar uma melhor compreensão do impacto de urânio na fisiologia do osso e pode fornecer uma ferramenta nova e interessante para o rastreio de quelantes de urânio. Além disso, acreditamos que o protocolo descrito aqui pode ser aplicado para estudar o impacto de outros metais pesados na osteoclatogenesis.
<p cla…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria agradecer Cros Chantal por assistência técnica útil.
Esta pesquisa foi financiada por doações do “Commissariat à l’Energie Atomique et aux energias alternativas” (URANOs – programa Transversal de Toxicologie du CEA e CPRR CEA-AREVA) e da ANR (toxicidade de urânio: abordagem multi-nível de biomineralização processo no osso, ANR-16-CE34-0003). Este trabalho também foi apoiado pela Universidade de Nice Sophia-Antipolis e o CNRS.
Materials
| DMEM | Lonza | BE12-604F | |
| α-MEM | Lonza | BE12-169F | |
| EMEM without phenol red | Lonza | 12-668E | |
| Water for cell culture | Lonza | BE17-724F | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| HyClone fetal bovine serum | GE Life Sciences | SH30071.03 | |
| 7.5% sodium bicarbonate aqueous solution | Sigma-Aldrich | S8761 | |
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) powder | Sigma-Aldrich | M5655 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Alizarin Red S sodium salt, 1% w/v aq. sol. | Alfa Aeros | 42746 | |
| Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates | Corning Life Sciences | 3987 | |
| Multiwell 24 well plates | Falcon | 353504 | |
| Flask 75 cm2 | Falcon | 353133 | |
| Polypropylene Conical Tubes 50 ml | Falcon | 352070 | |
| Cell scrapers 30 cm | TPP | 90003 |
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