عزل السالمونيلا تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة
Summary
يصف لنا هنا طريقة بسيطة وسريعة لعزل السالمونيلا تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة بطلاء البكتيريا مع البيوتين وستريبتافيدين.
Abstract
Typhimurium السالمونيلا هو بكتيريا داخل الخلايا اختياري الذي يسبب التهاب المعدة والأمعاء في البشر. وبعد غزو بروبريا الصفيحة, S. البكتيريا تيفيموريوم يتم بسرعة الكشف عن فاجوسيتيزيد التي الضامة والواردة في حويصلات المعروفة فاجوسوميس من أجل أن يتحلل. عزل من س. تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس قد استخدمت على نطاق واسع لدراسة كيفية س. العدوى تيفيموريوم يغير عملية نضج يبلوع لمنع تدهور البكتيرية. كلاسيكي، عزل المحتوية على البكتيريا فاجوسوميس قامت به السكروز التدرج الطرد المركزي. بيد أن هذه العملية تستغرق وقتاً طويلاً، ويتطلب معدات متخصصة ودرجة معينة من المهارة. الموصوفة هنا طريقة بسيطة وسريعة لعزل س. تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة بطلاء البكتيريا مع البيوتين-ستريبتافيدين-مترافق الخرز المغناطيسية. يمكن تعليق فاجوسوميس التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة في أي مخزن من الاختيار، مما يتيح الاستفادة فاجوسوميس معزولة لمجموعة واسعة نطاق من فحوصات، مثل تحليل المستقلب، البروتين والدهن. باختصار، هذا الأسلوب لعزل س. تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس محددة، وتتسم بالكفاءة، السريعة، يتطلب الحد الأدنى من المعدات، وهو أكثر تنوعاً من الأسلوب الكلاسيكي للعزل بواسطة السكروز التدرج-تنبيذ فائق.
Introduction
يتم تعميم الضامة الخلايا متجولة المتخصصة التي كشف وتبتلع وتحط أي الجسيمات الأجنبية موجودة في الأنسجة المحيطية، بدءاً من الخلايا أبوبتوتيك إلى غزو الكائنات الدقيقة مثل البكتيريا. عند الحصول على الاعتراف بوساطة مستقبلات سطحية الممرض علامات محددة عادة موجودة على السطح من الكائنات الحية الدقيقة (المعروفة باسم أنماط الجزيئية المرتبطة بالعوامل الممرضة أو بامبس)، الضامة الشروع في إعادة تنظيم معقدة للغشاء الخلوي في النظام المحيطي و الممرض1فاجوسيتيزي.
ثم يرد الممرض انجولفيد بلعم في حويصلة داخل الخلايا المعروفة باسم يبلوع. من خلال سلسلة من الانصهار والانشطار الأحداث مع حويصلات أخرى مثل اندوسوميس وليسوسوميس، يكتسب يبلوع التي تحتوي على الكائنات الممرضة مجموعة من البروتينات اللازمة للقضاء على المحتوى فاجوسومال. ولذلك تكوين الانزيمية يبلوع اختلافاً كبيرا أثناء هذه العملية، المعروفة باسم يبلوع نضوج2.
بعد قليل من البلعمه، مولتيميريك ATPase رغوي المعقدة (الخامس-ATPase) أدمجت في الغشاء يبلوع بالانصهار مع اندوسوميس3. يستخدم هذا المركب ATP لمضخة البروتونات من سيتوسول إلى التجويف يبلوع4. تحمض يبلوع أمر ضروري لإحداث الانصهار مع غيرها من حويصلات5 لتفعيل عدد كبير من إنزيمات بوليمرات تعتمد على درجة الحموضة6. آخر مولتيميريك الانزيمية المعقدة التي يتم تجميعها بسرعة على الغشاء يبلوع هو مجمع نادف-أوكسيديز (NOX). أكاسيد النيتروجين المعقدة يكسد نادف بغية إنتاج الأنواع الأكسجين التفاعلية (روس) التي هي مخفي في التجويف يبلوع، وأن تسهم إسهاما كبيرا في قتل الكائنات الحية الدقيقة التي اجتاحت7.
أثناء الخطوات الأولى من النضج، يقدم فاجوسوميس علامات عادة مثل Rab5 و Rab7 من اندوسوميس المبكرة والمتأخرة على التوالي جنبا إلى جنب مع وحدة فرعية0 V v-ATPase8. نتائج انصهار فاجوسوميس مع ليسوسوميس واندوسوميس الراحل في التعرض لمسببات المرض فاجوسيتيزيد لمجموعة متنوعة من الإنزيمات هيدروليكي مثل البروتياز كاثيبسين، ليباسيس، وبيتا-جالاكتوسيداسي9. تحمض التجويف مطلوب أيضا لتفعيل هذه الإنزيمات. على سبيل المثال، هو انقسام كاثيبسين د لإنتاج النموذج القصير نشطة تعتمد على درجة الحموضة10. هذه الإنزيمات تتحلل مسببات المرض والتوسط من أجل إنتاج الببتيدات القصيرة المستمدة من العوامل الممرضة التي ترد بها بلعم histocompatibility الرئيسية (MHC) الفئة الثاني جزيئات معقدة لخلايا تي يؤدي استجابة المناعية تكيفية11.
ومن ثم، نضوج يبلوع حاسمة بالنسبة للاستجابة المناعية الفطرية ووصلات بالأسلحة الفطرية والتكيف في الجهاز المناعي. لا عجب أن مسببات الأمراض تطورت استراتيجيات للتغلب على القضاء بالضامة خلال عملية النضج يبلوع الموصوفة أعلاه. على سبيل المثال، منع البكتيريا داخل الخلايا متفطره و المستروحة فيلقيه يبلوع نضوج المثبطة الخامس-ATPase الجمعية وما يترتب عليها من التجويف التحمض12،13 . حمل البكتيريا الأخرى، مثل الليستريه المستوحدة أو فليكسنيري دوسنتاريا تشكيل المسام في غشاء يبلوع الهروب إلى14،سيتوسول15. من ناحية أخرى، انتيريكا السالمونيلا سرفار تيفيموريوم (S. تيفيموريوم) غير قادرة على تعديل خصائص يبلوع داخل المنقبضة لتحويله إلى موقع مناسب ل النسخ المتماثل16. هذه القدرة يجعل س. تيفيموريوم نموذجا مثيرا للاهتمام لدراسة التدخل الممرض بوساطة من النضج يبلوع.
س. تيفيموريوم هو بكتيريا داخل الخلايا اختياري الذي يسبب التهاب المعدة والأمعاء في البشر. وبعد غزو بروبريا الصفيحة، س. البكتيريا تيفيموريوم يتم بسرعة الكشف عن فاجوسيتيزيد التي الضامة والواردة ضمن فاجوسوميس17. ووصفت بعض تقارير سبق أن س. تيفيموريوم-فاجوسوميس التي تحتوي على صناع ل اندوسوميس وليسوسوميس18، وقد وجدت دراسات أخرى الانصهار يبلوع-يحلول حالت دون بناء س. تيفيموريوم العدوى19.
وفي البداية، يبلوع النضج عند س. كانت قد أجرت التحقيق الإصابة تيفيموريوم المجهري الفلورة. تطوير تقنيات لعزل المحتوية على البكتيريا فاجوسوميس تمكين إجراء دراسة أكثر دقة لمحتوى يبلوع من حيث علامات دخلول ويحلول. وحتى الآن، والطريقة الرئيسية المستخدمة لعزل المحتوية على البكتيريا فاجوسوميس هو تجزئة سوبسيلولار على السكروز خطوة التدرجات18،20. ومع ذلك، يتطلب هذا الأسلوب عدة خطوات الطرد المركزي التي يمكن أن تتسبب في الأضرار الميكانيكية إلى فاجوسوميس ويمكن أن يؤثر على استقرار مكونات فاجوسومال (البروتينات والدهون) ومضيعة للوقت. وعلاوة على ذلك، فإنه يتطلب استخدام أولتراسينتريفوجي: قطعة من المعدات المتخصصة التي لا يمكن الوصول إليها لكل مختبر.
مؤخرا، تم تطبيق نهج جديد لعزل المحتوية على البكتيريا فاجوسوميس، التي وصفت مسببات الأمراض البكتيرية مع بيوتينيلاتيد ليبوبيتيدي (ليبوبيوتين) وفي وقت لاحق المستخرجة باستخدام الخرز المغناطيسي مترافق ستريبتافيدين21 . ونحن نقترح طريقة تكميلية بديلة بوسم البكتيرية الجزيئات السطحية التي تحتوي على أمين مع دائرة الصحة الوطنية–البيوتين تليها مترافق streptavidin الخرز المغناطيسية. فاجوسوميس التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة يتم التخصيب في علامات دخلول ويحلول ويمكن استخدامه لمجموعة واسعة نطاق من فحوصات، من تحليل البروتين بتحليل اوميكس. بالإضافة إلى ذلك، فإنه لا يتطلب معدات متخصصة مثل أولتراسينتريفوجيس. وعلاوة على ذلك، عن طريق القضاء على الخطوات الطرد المركزي، الأضرار الميكانيكية إلى فاجوسوميس ومقدار الوقت المستخدمة هي خفض كبير. هذا الأسلوب يمكن تكييفها بسهولة لعزل فاجوسوميس التي تحتوي على البكتيريا الأخرى، مثل إيجابية المكوّرات العنقودية الذهبية، وشملت أيضا في هذه المخطوطة. باختصار، هذا الأسلوب لعزل س. تيفيموريوم-تحتوي على فاجوسوميس وبسيطة وفعالة من حيث التكلفة، وأقل استهلاكاً للوقت من عزلة الكلاسيكية من السكروز أثري تنبيذ فائق التدرج، مما يجعل درجة عالية فاجوسوميس المحتوية على البكتيريا.
Protocol
Representative Results
Discussion
أسلوب جديد لعزل س. تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس بطلاء البكتيريا مع البيوتين ومترافق streptavidin المغناطيسي الخرز ويرد هنا. بعد تعطل رقيقة من غشاء الخلية، فاجوسوميس المحتوية على البكتيريا ويمكن بسهولة استخراج استخدام رف مغناطيسي. نظهر أن وسم البكتيريا يحافظ على قدرة مسببات ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
البحوث في مختبر لروبنسون هي مدعومة بتمويل من “كولونيا التميز الكتلة” على “استجابات الإجهاد الخلوية” في “الأمراض أجينجاسوسياتيد”، جامعة كولونيا، ألمانيا (سكاد؛ تمولها DFG ضمن “مبادرة الامتياز” للحكومة الاتحادية الألمانية و الدولة الحكومات) والمنح المقدمة من دويتشه الأوقيانوغرافية (SFB 670) وثروة كولون ومؤسسة ماريا Pesch من جامعة كولونيا، ألمانيا.
Materials
| EZ-Link NHS Biotin | Thermo Fisher Scientific | 20217 | |
| FluidMag Streptavidin | Chemicell | 4205 | |
| PIPES | Carl Roth | 9156.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | A537.4 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Mannitol | Carl Roth | 4175.1 | |
| DTT | Sigma | 43816 | |
| Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Fisher Scientific | 1861280 | |
| Cytochalasin B | Sigma | C6762 | |
| DYNAL or DynaMag Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| SmartSpec 3000 Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2501 | |
| Bacterial loop (10µl) | Sarstedt | 86.1562.010 | |
| Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 | Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures | ||
| RPMI | Biochrom | FG1415 | |
| PBS | Biochrom | L1825 | |
| Cy5-streptavidin | Invitrogen | SA1011 | |
| anti-beta-actin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| anti-mCherry antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-34974 | |
| anti-Rab5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46692 | |
| anti-Rab7 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-10764 | |
| anti-v-ATPase (V0) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-28801 | |
| anti-v-ATPase (V1) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20943 | |
| anti-cathepsin D antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-6486 | |
| anti-Tomm20 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17764 | |
| anti-calnexin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46669 | |
| anti-GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20357 |
References
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262 (1), 193-215 (2014).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat Rev Mol Cell Bio. 9 (10), 781-795 (2008).
- Lafourcade, C., Sobo, K., Kieffer-Jaquinod, S., Garin, J., van der Goot, F. G. Regulation of the V-ATPase along the Endocytic Pathway Occurs through Reversible Subunit Association and Membrane Localization. Plos One. 3 (7), e2758 (2008).
- Forgac, M. Vacuolar ATPases: rotary proton pumps in physiology and pathophysiology. Nat Rev Mol Cell Bio. 8 (11), 917-929 (2007).
- Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).
- Ullrich, H. J., Beatty, W. L., Russell, D. G. Direct delivery of procathepsin D to phagosomes: Implications for phagosome biogenesis and parasitism by Mycobacterium. Eur J Cell Biol. 78 (10), 739-748 (1999).
- Bedard, K., Krause, K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology. Physiol Rev. 87 (1), 245-313 (2007).
- Haas, A. The phagosome: Compartment with a license to kill. Traffic. 8 (4), 311-330 (2007).
- Scott, C. C., Botelho, R. J., Grinstein, S. Phagosome maturation: A few bugs in the system. J Membrane Biol. 193 (3), 137-152 (2003).
- Turk, V., et al. Cysteine cathepsins: From structure, function and regulation to new frontiers. Bba-Proteins Proteom. 1824 (1), 68-88 (2012).
- Ramachandra, L., Song, R., Harding, C. V. Class II MHC molecules and peptide complexes appear in phagosomes during phagocytic antigen processing. Faseb J. 12 (4), A589-A589 (1998).
- Robinson, N., et al. Mycobacterial Phenolic Glycolipid Inhibits Phagosome Maturation and Subverts the Pro-inflammatory Cytokine Response. Traffic. 9 (11), 1936-1947 (2008).
- Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. Mycobacterium tuberculosis and Legionella pneumophila phagosomes exhibit arrested maturation despite acquisition of Rab7. Infect Immun. 68 (9), 5154-5166 (2000).
- Smith, G. A., et al. The two distinct phospholipases C of Listeria monocytogenes have overlapping roles in escape from a vacuole and cell-to-cell spread. Infect Immun. 63 (11), 4231-4237 (1995).
- Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol Res. 41 (3), 188-202 (2008).
- Gallois, A., Klein, J. R., Allen, L. A. H., Jones, B. D., Nauseef, W. M. Salmonella pathogenicity island 2-encoded type III secretion system mediates exclusion of NADPH oxidase assembly from the phagosomal membrane. J Immunol. 166 (9), 5741-5748 (2001).
- Ohl, M. E., Miller, S. I. Salmonella: A model for bacterial pathogenesis. Annu Rev Med. 52, 259-274 (2001).
- Mills, S. D., Finlay, B. B. Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y-pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded. Eur J Cell Biol. 77 (1), 35-47 (1998).
- Buchmeier, N. A., Heffron, F. Inhibition of Macrophage Phagosome-Lysosome Fusion by Salmonella-Typhimurium. Infect Immun. 59 (7), 2232-2238 (1991).
- Luhrmann, A., Haas, A. A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages. Methods Cell Sci. 22 (4), 329-341 (2000).
- Steinhauser, C., et al. Lipid-labeling facilitates a novel magnetic isolation procedure to characterize pathogen-containing phagosomes. Traffic. 14 (3), 321-336 (2013).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Detilleux, P. G., Deyoe, B. L., Cheville, N. F. Entry and intracellular localization of Brucella spp. in Vero cells: fluorescence and electron microscopy. Vet Pathol. 27 (5), 317-328 (1990).
- Arenas, G. N., Staskevich, A. S., Aballay, A., Mayorga, L. S. Intracellular trafficking of Brucella abortus in J774 macrophages. Infect Immun. 68 (7), 4255-4263 (2000).
- West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).
- Li, Q., Jagannath, C., Rao, P. K., Singh, C. R., Lostumbo, G. Analysis of phagosomal proteomes: from latex-bead to bacterial phagosomes. Proteomics. 10 (22), 4098-4116 (2010).
- Rao, P. K., Singh, C. R., Jagannath, C., Li, Q. A systems biology approach to study the phagosomal proteome modulated by mycobacterial infections. Int J Clin Exp Med. 2 (3), 233-247 (2009).
- Rogers, L. D., Foster, L. J. The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum. P Natl Acad Sci USA. 104 (47), 18520-18525 (2007).
