Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen
Summary
Wir beschreiben hier eine einfache und schnelle Methode zur Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen durch die Beschichtung der Bakterien mit Biotin und Streptavidin.
Abstract
Salmonella Typhimurium ist ein fakultativ intrazellulären Bakterium, das Gastroenteritis beim Menschen verursacht. Nach der Invasion der Lamina Propria, S. Typhimurium Bakterien sind schnell erkannt und durch Makrophagen phagozytiert und enthielt in Vesikel genannt Phagosom um abgebaut werden. Isolierung von S. Typhimurium-enthaltenden Phagosom studieren verbreitet wie S. Typhimurium Infektion verändert den Prozess der Reifung Phagosom, bakteriellen Abbau zu verhindern. Klassisch, die Isolierung der Bakterien-haltigen Phagosom von Saccharose-Gradienten-Zentrifugierung durchgeführt wurde. Aber dieser Prozess ist zeitaufwändig und erfordert spezialisierte Ausrüstung und ein gewisses Maß an Geschicklichkeit. Hier ist eine einfache und schnelle Methode zur Isolierung von S. Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen durch die Beschichtung der Bakterien mit magnetischen Beads Biotin-Streptavidin-konjugiert. Phagosom erhalten durch diese Methode können in jeder Puffer der Wahl, so dass die Verwendung von isolierten Phagosom für ein breites Spektrum von Assays, wie Eiweiß, Metaboliten und Lipid-Analyse ausgesetzt werden. Fazit: Diese Methode für die Isolierung von S. Typhimurium-mit Phagosom ist spezifisch, effizient, schnell, erfordert eine minimale Ausstattung und ist vielseitiger als die klassische Methode der Isolation von Saccharose Farbverlauf-Ultrazentrifugation.
Introduction
Makrophagen im Umlauf sind spezialisierter phagocytic Zellen, die erkennen, verschlingen und Fremdkörper in peripheren Geweben, von apoptotischen Zellen bis hin zu eindringenden Mikroorganismen wie Bakterien abgebaut. Auf Oberfläche Rezeptor-vermittelte Anerkennung Erreger spezifischer Marker auf der Oberfläche von Mikroorganismen (bekannt als Pathogen-assoziierte molekulare Muster oder PAMPs) häufig vorhanden initiieren Makrophagen eine komplexe Reorganisation der Zellmembran in Bestellung zu umgeben und phagocytize der Erreger-1.
Die verschlungen Erreger ist dann durch die Makrophagen in einem intrazellulären Vesikel genannt Phagosom enthalten. Durch eine Reihe von Kernfusion und Kernspaltung Veranstaltungen mit anderen Vesikel wie Endosomen und Lysosomen erwirbt die Erreger-haltigen Phagosom eine Reihe von Proteinen, die für die Beseitigung des phagosomal Inhalts erforderlich. Daher ist die enzymatische Zusammensetzung der Phagosom im Laufe dieses Prozesses, bekannt als Phagosom Reifung2sehr variabel.
Kurz nach der Phagozytose, Multimeric, die komplexe vacuolar ATPase (V-ATPase) durch Fusion mit Endosomen3Phagosom Membran integriert ist. Die Anlage nutzt ATP zu Pumpe Protonen aus dem Zytosol in das Lumen der Phagosom4. Versauerung der Phagosom ist unerlässlich für die Fusion-Veranstaltungen mit anderen Vesikel5 und für die Aktivierung einer großen Anzahl von pH-abhängigen abbauende Enzyme6. Ein weiterer Multimeric enzymatischen Komplex, die schnell auf der Membran Phagosom montiert ist ist der NADPH-Oxidase (NOX) Komplex. Komplexe NOX oxidiert NADPH um reaktive Sauerstoffspezies (ROS), werden in das Phagosom Lumen abgesondert und, die wesentlich dazu beitragen, die Tötung der verschlungen Mikroorganismen7,zu produzieren.
Während die ersten Schritte der Reifung präsentieren Phagosom Marker in der Regel wie Rab5 und Rab7 der frühen und späten Endosomen bzw. zusammen mit der V-0 -Untereinheit des V-ATPase8. Fusion von Phagosom mit Lysosomen und späten Endosomen führt die Belichtung der phagocytized Erreger, eine Vielzahl von hydrolytische Enzyme wie Cathepsin Proteasen, Lipasen und β-Galaktosidase9. Versauerung des lumens ist auch erforderlich für die Aktivierung dieser Enzyme. Beispielsweise ist die Spaltung von Cathepsin D, die aktive Kurzform zu produzieren pH-abhängigen10. Diese Enzyme erniedrigen den Erreger und vermitteln die Herstellung von Pathogen-abgeleitete kurze Peptide, die durch die Makrophagen große Histocompatibility Komplexes (MHC) Klasse II Moleküle auf T-Zellen eine adaptive Immunantwort11auslösen dargestellt werden.
Daher Phagosom Reifung ist entscheidend für die angeborene Immunantwort und verbindet die angeborene und adaptive Waffen des Immunsystems. Es ist keine Überraschung, dass die Erreger Strategien zur Beseitigung von Makrophagen durch den oben beschriebenen Prozess der Reifung Phagosom Überwindung entwickelt haben. Beispielsweise verhindert die intrazellulären Bakterien Mycobacterium Tuberculosis und Legionella Pneumophila Phagosom Reifung durch hemmende V-ATPase Montage- und konsequente Lumen Versauerung12,13 . Andere Bakterien wie Listeria Monocytogenes oder Shigella Flexneri induzieren Porenbildung in der Phagosom Membran in die Zellflüssigkeit14,15zu entkommen. Auf der anderen Seite, Salmonella Enterica Serovar Typhimurium (S. Typhimurium) zum Ändern der Eigenschaften von Phagosom in die Vakuole, es in einen geeigneten Standort für ihre Replikation16verwandeln kann. Diese Fähigkeit macht S. Typhimurium ein sehr interessantes Modell Erreger-vermittelte Störungen von Phagosom Reifung zu studieren.
S. Typhimurium ist ein fakultativ intrazellulären Bakterium, das Gastroenteritis beim Menschen verursacht. Nach der Invasion der Lamina Propria, S. Typhimurium Bakterien werden schnell erkannt und durch Makrophagen phagozytiert und enthaltenen Phagosom17. Einige Berichte haben, dass S. oben beschrieben. Typhimurium-enthaltenden Phagosom präsentieren Hersteller für Endosomen und Lysosomen18, und andere Studien ergaben Phagosom-Lysosomen Fusion verhindert auf S. Typhimurium Infektion19.
Zunächst Phagosom Reifung auf S. Typhimurium Infektion ist durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie untersucht worden. Die Entwicklung von Techniken für die Isolierung der Bakterien-haltigen Phagosom ermöglichte eine genauere Studie über das Phagosom Inhalte in Bezug auf Endosom und Lysosomen Marker. Bis heute ist die main-Methode verwendet für die Isolierung der Bakterien-haltigen Phagosom ist der subzellulären Fraktionierung auf Saccharose Schritt Steigungen18,20. Diese Methode erfordert jedoch mehrere Zentrifugation Schritte, die Phagosom mechanische beschädigen können, beeinflussen die Stabilität der phagosomal Komponenten (Proteine und Lipide) und nimmt Zeit in Anspruch. Darüber hinaus erfordert die Verwendung einer Ultrazentrifuge: ein Stück von Spezialausrüstungen, die nicht für jedes Labor zugänglich ist.
Vor kurzem ein neuer Ansatz zur Isolierung der Bakterien-haltigen angewendet wurde Phagosom, in denen bakterielle Erreger mit biotinylierte Lipopetide (Lipobiotin) und später beschriftet sind mit Streptavidin-konjugiert magnetische Beads21 extrahiert . Wir schlagen eine alternative komplementäre Methode durch bakterielle Oberfläche Amin-haltigen Makromoleküle mit NHS-Biotin labeling von Streptavidin konjugiert magnetische Beads gefolgt. Phagosom erhalten durch diese Methode sind hochangereichertes im Endosom und Lysosomen Marker und können für eine breite Palette von Assays aus Protein-Analyse, Analyse der Omics verwendet werden. Darüber hinaus erfordert es keine Spezialausrüstung wie Ultrazentrifugen. Darüber hinaus werden durch den Wegfall der Zentrifugation Schritte, die mechanische Beschädigung Phagosom und der Höhe der Zeit beschäftigt erheblich reduziert. Diese Methode kann leicht für die Isolierung von Phagosom mit anderen Bakterien, wie z. B. die grampositive Staphylococcus Aureus, ebenfalls in dieser Handschrift angepasst werden. Fazit: Diese Methode für die Isolierung von S. Typhimurium-mit Phagosom ist eine einfache, kostengünstige, und weniger zeitaufwändig als die klassische Trennung von Saccharose Farbverlauf-Ultrazentrifugation, Rendern sehr bereichert Bakterien-haltigen Phagosom.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eine neue Methode für die Isolierung von S. Typhimurium-mit Phagosom durch die Beschichtung der Bakterien mit Biotin und magnetische Beads Streptavidin konjugiert wird hier beschrieben. Nach sanften Unterbrechung der Zellmembran können Bakterien-haltigen Phagosom leicht mit einem magnetischen Rack extrahiert werden. Wir zeigen, dass die Kennzeichnung der Bakterien die Fähigkeit des Erregers induzieren Entzündungen bewahrt und ändert nichts an der phagocytic Eigenschaft der Wirtszelle. Wichtig ist, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forschung in der Robinson Lab wird unterstützt durch Mittel aus Köln-Exzellenz-Cluster auf zelluläre Stressreaktionen im Aging-Associated Krankheiten, Universität zu Köln, Deutschland (CECAD; gefördert durch die DFG im Rahmen der Exzellenzinitiative des Bundes und staatliche Regierungen) und Zuschüsse aus der Deutschen Forschungsgemeinschaft (SFB 670), Köln Fortune und Maria Pesch-Stiftung der Universität zu Köln.
Materials
| EZ-Link NHS Biotin | Thermo Fisher Scientific | 20217 | |
| FluidMag Streptavidin | Chemicell | 4205 | |
| PIPES | Carl Roth | 9156.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | A537.4 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Mannitol | Carl Roth | 4175.1 | |
| DTT | Sigma | 43816 | |
| Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Fisher Scientific | 1861280 | |
| Cytochalasin B | Sigma | C6762 | |
| DYNAL or DynaMag Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| SmartSpec 3000 Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2501 | |
| Bacterial loop (10µl) | Sarstedt | 86.1562.010 | |
| Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 | Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures | ||
| RPMI | Biochrom | FG1415 | |
| PBS | Biochrom | L1825 | |
| Cy5-streptavidin | Invitrogen | SA1011 | |
| anti-beta-actin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| anti-mCherry antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-34974 | |
| anti-Rab5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46692 | |
| anti-Rab7 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-10764 | |
| anti-v-ATPase (V0) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-28801 | |
| anti-v-ATPase (V1) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20943 | |
| anti-cathepsin D antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-6486 | |
| anti-Tomm20 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17764 | |
| anti-calnexin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46669 | |
| anti-GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20357 |
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