Applicazione del sistema di coltura Explant Aorta-gonade-Mesonefro nell'ematopoiesi inerente allo sviluppo
Summary
Questo protocollo descrive l’utilizzo coltivate Aorta-gonade-Mesonephros per analisi di espressione, unità formanti colonia in cultura e milza e ricostituzione a lungo termine per determinare l’effetto di fattori regolatori e vie di segnalazione su staminali ematopoietiche sviluppo delle cellule. Questo è stato dimostrato come un sistema efficace per lo studio della funzione e biologia delle cellule staminali ematopoietiche.
Abstract
La limitazione dell’utilizzo di embrioni di topo per studi di ematopoiesi è l’inconveniente aggiunto nelle operazioni, che è in gran parte dovuto lo sviluppo intrauterino dell’embrione. Anche se sono convincenti dati genetici da topi knockout (KO), non è realistico per generare topi KO per i geni tutti come necessario. Inoltre, esibendosi in vivo gli esperimenti di salvataggio per consolidare i dati ottenuti da topi KO non è conveniente. Per superare queste limitazioni, la cultura di espianto Aorta-gonade-Mesonephros (AGM) è stata sviluppata come un sistema appropriato per studiare lo sviluppo di cellule staminali ematopoietiche (HSC). Soprattutto per gli esperimenti di salvataggio, può essere utilizzato per recuperare l’ematopoiesi alterata in topi KO. Con l’aggiunta di prodotti chimici appropriati nel mezzo, la segnalazione alterata può essere riattivata o vie di up-regolato possono essere inibite. Con l’uso di questo metodo, molti esperimenti possono essere eseguite per identificare i regolatori critici dello sviluppo di HSC, compreso HSC correlati espressione genica a livelli di mRNA e proteina, capacità di formazione di Colonia e la capacità di ricostituzione. Questa serie di esperimenti sarebbe utile nel definire i meccanismi di fondo essenziali per lo sviluppo di HSC nei mammiferi.
Introduction
Cellule staminali ematopoietiche (HSCs) sono cellule staminali adulte tessuto-specifici che possiedono multilineare potenziale compreso degli eritrociti, mieloidi e cellule linfoidi come pure la capacità di auto-rinnovarsi. Recenti studi hanno dimostrato che i primi HSCs è sorto da una popolazione endoteliale specializzata, nota come endotelio hemogenic (HE), attraverso l’endoteliale di transizione ematopoietico (EHT) presso la parete ventrale dell’aorta dorsale1,2 ,3,4. Una volta formato regione aorta-gonade-mesonephros (AGM) da embrionali (E) 10.5 a 12.5 in embrione di topo, HSCs migrare nel fegato fetale per espansione e infine colonizzare il midollo osseo per mantenere l’ematopoiesi adulto per tutta la vita di un individuo 5 , 6. anche se questo è stato studiato per molti anni, i meccanismi di fondo di HSC emersione e sviluppo rimangono in modo incompleto capiti.
A differenza di fecondazione in vitro e sviluppo di embrioni di zebrafish, lo sviluppo intrauterino degli embrioni del mouse rende lo studio dell’emopoiesi definitiva durante l’embriogenesi molto più scomodo. Anche se gli esperimenti genetici, utilizzando topi knockout (KO) sono comunemente utilizzati, la mancanza di alcuni topi KO anche limita il loro uso nel campo della ricerca ematopoietico. Inoltre, in vivo gli esperimenti di salvataggio non sono facilmente eseguiti nei topi KO. Dal 1996, la cultura di espianto AGM è stata sviluppata per gli studi ematopoietici dai pionieri nel campo7. Con l’aiuto di questo sistema di coltura, tessuti ventrale della regione AGM sono stati identificati per promuovere attività HSC, mentre tessuti dorsale esercitano un opposto effetto8,9. Il sistema di coltura explant AGM è stato applicato anche per determinare i ruoli di serotonina, Mpl, SCF, BMP e Hedgehog signaling in HSC sviluppo10,11,12,13, 14. la cosa importante, è anche un metodo popolare usato per salvare ematopoietici difetti in embrioni mutanti13,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
È noto che HSCs maturo nel midollo osseo può ripopolare il sistema sangue di destinatari irradiati. A differenza di questi HSCs funzionale, le HSCs emergenti in AGM degli embrioni del mouse sono immaturi. Risultati di trapianto diretto ha mostrato quel tipo mi (VE-cad+ CD45– CD41+) e tipo II (VE-cad+ CD45+) pre-HSCs possedere nessuna capacità di ricostituzione20. Sfruttando il sistema di coltura explant AGM, il nascente HSCs nella regione…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Suwei Gao per aiuto nella preparazione di figura. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Foundation Natural Science of China (81530004, 31425016) e il Ministero della scienza e tecnologia della Cina (2016YFA0100500). J.L. eseguito gli esperimenti e redatto il manoscritto; F.L. modificato il manoscritto. Entrambi gli autori letto ed approvato il manoscritto finale.
Materials
| durapore 0.65 µm filters | Millipore | R5BA63787 | AGM explant culture |
| M5300 long-term culture medium | Stem Cell Technologies | 5300 | AGM explant culture |
| Trizol | Tiangen | 5829 | RNA extration |
| M-MLV reverse transcriptase | Promega | 90694 | reverse transcription |
| SYBR Green | Qiagen | A6002 | quantatitive real-time PCR |
| protease inhibitor | Roche | 55622 | Protein extration |
| collagenase | Sigma | C2674 | digestion of AGM tissues |
| MethoCult GF M3434 medium | Stem Cell Technologies | 3434 | CFU-C assay |
| ultra-low attachment 24-well plates | Costar | 3473 | CFU-C assay |
| C57BL/6 CD45.2 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | CFU-S assay | |
| C57BL/6 CD45.1 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | Long-term transplantation | |
| phosphate buffered saline | Life Technologines | 8115284 | AGM Collection |
| Penicillin-Streptomycin solution | HyClone | SV30010 | AGM explant culture |
| anti-CD45.2-PE-CY7 | eBioscience | 25-0454-80 | Long-term transplantation |
| anti-CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | Long-term transplantation |
| UV lamp | Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD | 039-14402 | power: 30W |
| stainless steel mesh | AS ONE SHANGHAI Corporation | 2-9817-10 | aperture diameter: 2.5 mm |
| hydrocortisone | Sigma | H0396 | selectively diluted into M5300 medium |
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