Un análisis Simple reportero basado en fluorescencia para identificar los componentes celulares necesarios para la toxina de ricina una cadena (RTA) trata de levadura
Summary
En el manuscrito, describimos el uso de un análisis de reportero de fluorescencia basada en levadura a identificar componentes celulares implicados en la trata de personas y matar procesos de los citotóxicos a una subunidad de la ricina toxina de planta (RTA).
Abstract
Bacteriana y planta A / toxinas B explotan las vías de tráfico naturales en las células eucariotas para llegar a sus destinos intracelulares en el citosol y en última instancia matar. Tal A / toxinas B consisten en generalmente un enzimático activo Asubunit (p. ej., toxina de ricina (RTA)) y una o más células enlace Bsubunit(s), que es responsables de toxina vinculante específico para receptores de superficie celular. Nuestro conocimiento actual de cómo A las toxinas B son capaces de intoxicar eficientemente células ayudó a los científicos para entender los mecanismos celulares fundamentales, como la endocitosis y la proteína intracelular clasificación en células eucariotas superiores. Desde un punto de vista médico, asimismo es importante identificar las rutas de tráfico principales toxina para encontrar soluciones de tratamiento adecuada para pacientes o para eventualmente desarrollar aplicaciones terapéuticas de toxina para terapia del cáncer.
Desde el análisis del genoma del tráfico en células de mamíferos la toxina B es complejo, lento y caro, varios estudios sobre una / transporte de la toxina B han llevado a cabo en el organismo del modelo de la levadura Saccharomyces cerevisiae. A pesar de ser menos complejos y fundamentales procesos celulares de levadura y las células eucariotas superiores pueden transferirse a la situación mamífera son similares y muy a menudo los resultados obtenidos en la levadura.
Aquí, describimos un análisis reportero rápido y fácil de utilizar para analizar el tráfico intracelular de RTA en la levadura. Una ventaja esencial de la prueba de nuevo es la oportunidad para investigar no sólo retro-desplazamiento de RTA desde el retículo endoplásmico (ER) en el citosol, pero algo endocitosis y toxina retrógrada transportan de la membrana del plasma en la sala de emergencia. El ensayo hace uso de un plásmido reportero que permite una medición indirecta de la toxicidad de la RTA a través de emisión de fluorescencia de la proteína fluorescente verde (GFP) después de la traducción en vivo . Como RTA eficientemente previene la iniciación de la biosíntesis de la proteína por 28S rRNA depurinación, este ensayo permite la identificación de proteínas de la célula huésped involucrado en el transporte intracelular de RTA a través de la detección de cambios en la emisión de fluorescencia.
Introduction
Pacientes que sufren de infecciones por bacterias de producir la toxina representan una grave carga médica y financiera para cada sistema de salud social, en particular tratamientos terapéuticos eficaces son todavía en gran parte desaparecidos. Desarrollar nuevas estrategias terapéuticas, los mecanismos complejos de la intoxicación del médicamente relevante A las toxinas B como la toxina del cólera, Shiga toxina ricina necesita ser entendido completamente a nivel molecular basado en ensayos poderos novela que deben aplicarse.
En los últimos años, varios estudios intentaron analizar A / transporte de la toxina B en levaduras y células de mamíferos mediante métodos desperdiciadores de tiempo y costosa como toxina radiactivo etiquetado1,2 , así como basado en el siRNA se acerca a3. En algunos casos, trata de la toxina ha sido visualizado en vivo por microscopía de fluorescencia después de acoplamiento químico o genética de subunidades de la toxina individual con fluoróforos, puntos cuánticos o proteínas fluorescentes4,5. Por desgracia, tales modificaciones conducen a menudo a propiedades naturales inactivadas o alteradas de las toxinas. Otra forma elegante de responder indirectamente a una amplia variedad de cuestiones científicas es el uso de sistemas de reportero basados en enzimas como lacZ, luciferasa o proteínas fluorescentes (e.g. GFP o Discosoma sp. (proteína fluorescente roja dsRed)).
En este manuscrito, se describe un protocolo simple que identifica los componentes celulares necesarios para el transporte intracelular de RTA aplicada extracelularmente en S. cerevisiae. Por lo tanto, un plásmido reportero de fluorescencia que contiene una señal N-terminal ER-import seguida de GFP actúa como un sensor de la biosíntesis de proteína, que indirectamente mide la inhibición de la traducción de RTA-mediado proteína GFP fluorescencia emisión después de la en vivo traducción6. En caso que endocitosis RTA o tráfico intracelular negativamente (o positivamente) sufre en un mutante de levadura especial eliminación en comparación con el tipo salvaje, esto se puede detectar a través de un aumento (o disminución) en la fluorescencia de GFP emisión6.
Hasta ahora, todos los métodos de análisis de transporte de RTA en células de levadura fueron restringidos en el proceso de retro-desplazamiento ER al citosol de RTA. En un sistema tan artificial, que contiene una señal de importación ER RTA se expresa de un promotor inducible, resultando en un fenotipo suicida1,7. Aunque la célula Unión subunidad B de ricina es además que falta en la configuración experimental descrita en este manuscrito y, por lo tanto, no totalmente representa la situación natural de ricina holotoxin intoxicación8, transporte de la toxina del plasma membrana a través del aparato de Golgi al ER puede mímico de cerca con este ensayo novela. Curiosamente, los resultados preliminares obtenidos en el estudio piloto indican que las vías de tráfico utilizadas por RTA revelan similitudes sorprendentes con la ruta de intoxicación de ricina holotoxin.
En Resumen, el método descrito puede ser utilizado para determinar el papel específico de las proteínas celulares en endocitosis RTA y trata de levadura. Además, este montaje experimental podría ser fácilmente adaptado a otro ribosoma inactivar las toxinas producida y secretada de diversas levaduras y especies bacterianas como zymocin o toxina Shiga.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cuando se realiza el protocolo anterior, recomendamos las siguientes sugerencias para lograr un resultado exitoso del experimento.
Para la expresión de proteínas heterólogas, es importante no exceder la concentración de 1 mM IPTG. Concentraciones de IPTG > 1 mM inhibir expresión de RTA inducida por el promotor y plomo para bajar rendimientos de toxina. Además, las células no deben ser cultivadas a temperaturas superiores a 28 ° C para evitar la formación de cuerpo de inclusión, p…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Partes de este estudio fueron amablemente patrocinadas por una subvención de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 1027, A6).
Materials
| Bacterial and yeast strains | |||
| E coli BL21 DE3(Gold) | Aligent Technologies | 230130 | |
| S. cerevisiae BY4742 | Euroscarf | Y10000 | |
| S. cerevisiae BY4742 deletion mutants | Dharmacon | YSC1054 | whole collection |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids used in this protocol | |||
| pET24a(+) (Novagen) | Millipore | 69772-3 | |
| pET-RTA(His6) | Becker et al. (2016)3 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Zymolyase 20T | USBio | Z1000.250 | lytic enzyme for cell wall removal |
| LB broth medium | Thermo Scientific | 10855021 | 15 g agar was added for plate production |
| YNB | Thermo Scientific | DF0335-15-9 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Yeast drop-out mix supplemts without leucine | Sigma-Aldrich | Y1376-20G | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040-100G | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| D-raffinose | Sigma-Aldrich | 83400-25G | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-1KG | |
| D-galactose | Sigma-Aldrich | G0750-10MG | |
| G418 | Thermo Scientific | 11811031 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Imidazole | Roth | 3899.1 | |
| PAGE ruler prestained | Fermentas | 26616 | protein ladder used for Western analysis |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for RTA purification, desalting and reader measurements | |||
| Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro | Amersham | ||
| Soniprep 150 | MSE | old model, other models available | |
| Fluoroskan Ascent | Thermo Scientific | 5210470 | old model, not available anymore |
| ÄKTAPurifier | Thermo Scientific | 28406266 | Product is discontinued and replaced |
| HisTRAP HP column | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| HiTRAP desalting column | GE Healthcare | 11-0003-29 | |
| Midisart sterile filter | Sartorius | 16534K | 0.2 µm pore size |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| 660 nm assay kit | Thermo Scientific | 22660 | |
| 96 well plates | Thermo Scientific | 260860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (optional) | |||
| Anti-Tetra-His | Qiagen | 34670 | primary antibody; 1:1,000 dilution |
| Anti-mouse-HRP | Sigma-Aldrich | A9044-2ML | secondary antibody, 1:10,000 dilution |
References
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