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Medicine

लिपिड कोलेस्ट्रॉल कणों के मॉडुलन आकृति विज्ञान में कम करने दवाओं की विभेदक प्रभाव

Published: November 10, 2017 doi: 10.3791/56596
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 3, 1,4, 5
1Plaxgen Inc, 2Millipore Sigma, 3Cytometry Laboratories, Purdue University, 4San Francisco General Hospital, 2M16 Clinical Chemistry, University of California, San Francisco, 5Molecular Medicine Research Institute

Summary

इस अध्ययन का उद्देश्य कोलेस्ट्रॉल कणों की आकृति विज्ञान का नियमन करने में इन विट्रो लिपिड कम दवा प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था । लिपिड कम दवाओं की तुलना कोलेस्ट्रॉल कणों की रूपात्मक सुविधाओं नियमन में उनके प्रभाव में भिन्नता का पता चला.

Abstract

लिपिड कम दवाओं के साथ डिसलिपिडेमिया रोगियों का उपचार कम घनत्व लिपो (एलडीएल) स्तर में एक महत्वपूर्ण कमी की ओर जाता है और उच्च घनत्व लिपोप्रोटीन (एचडीएल) प्लाज्मा में कोलेस्ट्रॉल में वृद्धि के मध्यम स्तर के लिए एक कम है । फिर से, कोलेस्ट्रॉल कणों की आकृति विज्ञान और वितरण में फेरबदल में इन दवाओं की एक संभावित भूमिका खराब समझ है । यहाँ, हम कोलेस्ट्रॉल के संयोजन में पट्टिका सरणी विधि का उपयोग कर इमेजिंग प्रवाह cytometry के साथ रूपात्मक सुविधाओं का नियमन करने में लिपिड कम दवा प्रभाव का इन विट्रो मूल्यांकन का वर्णन. कोलेस्ट्रॉल कणों की छवि विश्लेषण संकेत दिया कि lovastatin, simvastatin, ezetimibe, और atorvastatin दोनों गोलाकार और रैखिक किनारा के आकार का कणों के गठन के लिए प्रेरित, जबकि नियासिन, fibrates, fluvastatin, और rosuvastatin प्रेरित केवल गोलाकार के आकार के कणों का गठन । अगले, शुद्ध बहुत कम घनत्व लिपोप्रोटीन (VLDL) और एलडीएल इन दवाओं के साथ मशीन के कणों की आकृति विज्ञान और कोलेस्ट्रॉल कण उपजनसंख्या की छवि बनावट में परिवर्तन दिखाया । इसके अलावा, ५० सीरम के नमूनों की स्क्रीनिंग डिसलिपिडेमिया के साथ विषयों में रैखिक आकार एचडीएल कोलेस्ट्रॉल कणों की एक उच्च स्तर की उपस्थिति का पता चला (मतलब १८.३%) की तुलना में आयु-मिलान सामान्य (११.१%) नमूनों का मतलब. हम भी लिपिड के आकार का एलडीएल और एचडीएल कोलेस्ट्रॉल कणों के नमूनों में गठन रैखिक कम करने पर दवा के प्रभाव में काफी बदलाव मनाया । इन निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि लिपिड कम दवाओं, उनके सेल मध्यस्थता hypolipidemic प्रभाव के अलावा, सीधे कार्रवाई की एक गैर एंजाइमी तंत्र द्वारा कोलेस्ट्रॉल कणों की आकृति विज्ञान मिलाना हो सकता है. इन परिणामों के परिणामों के लिए atherosclerosis के निदान को सूचित करने की क्षमता है और इष्टतम लिपिड कम चिकित्सा की भविष्यवाणी ।

Introduction

कई नैदानिक अध्ययन कम घनत्व लिपो के प्लाज्मा स्तर को कम करने में लिपिड कम दवाओं के लाभकारी प्रभाव का प्रदर्शन किया है (एलडीएल) कोलेस्ट्रॉल और उच्च घनत्व लिपोप्रोटीन (एचडीएल) कोलेस्ट्रॉल, में वृद्धि के मध्यम स्तर को कम करने के लिए जो atherosclerosis-संबंधित प्रतिकूल हृदय घटनाओं1,2,3,4,5के प्राथमिक और माध्यमिक दोनों घटनाओं को रोकता है । Statins, HMG-CoA रिडक्टेस एंजाइम अवरोधकों के एक समूह, जिगर में ब्लॉक अंतर्जात कोलेस्ट्रॉल संश्लेषण कि बारी नेतृत्व में रक्त6में एलडीएल कोलेस्ट्रॉल का स्तर कम घूम करने के लिए,7. इसी तरह, नियासिन के लिपिड कम प्रभाव hepatocyte diacylglycerol acyltransferase-2, एक प्रमुख जिगर एंजाइम ट्राइग्लिसराइड संश्लेषण8में शामिल की अपनी प्रत्यक्ष और गैर प्रतिस्पर्धी निषेध द्वारा मध्यस्थता की है. तुलनात्मक रूप से, ezetimibe नीमन के लिए बाध्यकारी द्वारा exogenous कोलेस्ट्रॉल के अवशोषण को सीमित करके एलडीएल के प्लाज्मा स्तर को कम कर देता है-C1 की तरह 1 (NPC1L1) प्रोटीन छोटी आंत की उपकला कोशिकाओं में स्थित9. फेनोफ़िब्रते, एक और लिपिड कम करने की दवा, काफी ट्राइग्लिसराइड्स के प्लाज्मा सांद्रता कम कर देता है और यह भी मामूली peroxisome proliferator के माध्यम से एलडीएल कोलेस्ट्रॉल-सक्रिय रिसेप्टर्स मार्ग10घटाता है । इसके अलावा ओमेगा-3 फैटी एसिड की सूचना दी जाती है जो एंटी-atherosclerotic को एलडीएल11के प्लाज्मा लेवल को कम करने की अपनी क्षमता के कारण प्रभावित करती है ।

लिपिड कम दवाओं, एलडीएल कोलेस्ट्रॉल को कम करने पर अपने प्राथमिक प्रभाव के अलावा, एचडीएल स्तर को बढ़ाने, endothelial कार्यों में सुधार, सूजन को कम करने, और प्लेटलेट बाधा सहित लाभकारी pleiotropic प्रभाव की एक संख्या है समुच्चय12,13,14। हालांकि, एचडीएल कोलेस्ट्रॉल के कणों को बढ़ाने और उनकी संरचनात्मक सुविधाओं को संशोधित करने में इन दवाओं का अंतर्निहित तंत्र पूरी तरह से समझ में नहीं आता । चूंकि इन दवाओं व्यापक रूप से atherosclerosis से संबंधित हृदय रोगों (सीवीडी) के इलाज के लिए निर्धारित कर रहे हैं, यह आगे रूपात्मक सुविधाओं और लिपिड कणों के वितरण का निर्धारण करने में उनकी संभव भूमिकाओं की जांच करने के लिए आवश्यक है । मानव प्लाज्मा lipidome लगभग ६०० अलग लिपिड और 22 विभिंन आकार, आकार, घनत्व, और रचनाओं में मौजूद है कि कोलेस्ट्रॉल के विभिंन आणविक प्रकार के होते है15,16,17 . ऐसे अल्ट्रा-केंद्रापसारक, एनएमआर, और ढाल जेल ट्रो के रूप में विश्लेषणात्मक तरीके एलडीएल और एचडीएल कणों और उनके उप अंश18,19की विशेषता के लिए प्रयोग किया जाता है । हालांकि, इन पद्धतियों के आवेदन के लिपिड कणों की आकृति विज्ञान और विधानसभा में दवाओं के प्रभाव का निर्धारण करने के उद्देश्य से अध्ययन करने के लिए सीमित है । प्रवाह cytometer आधारित पट्टिका सरणी एक कार्यात्मक जैव रासायनिक पता लगाने और सीरम व्युत्पंन लिपिड और amyloid पट्टिका कणों के दृश्य के लिए विकसित की परख है20। इस अध्ययन में वर्णित इन विट्रो इमेजिंग विधि के फायदे में परिवर्तन आकृति विज्ञान और बफर और सीरम नमूनों में कोलेस्ट्रॉल कणों के वितरण में लिपिड-नियमन दवा प्रभाव की पहचान सक्षम करें ।

Protocol

< p class = "jove_title" > 1. फ्लोरोसेंट-लेबल कोलेस्ट्रॉल और लिपिड कम दवाओं की तैयारी

< p class = "jove_content" > नोट: फ्लोरोसेंट-लेबल कोलेस्ट्रॉल समुच्चय और statins हमारे पिछले लेख में वर्णित के रूप में तैयार किया गया < सुप वर्ग = "xref" > २१ . कृपया तालिका के विवरण के लिए, इमेजिंग प्रवाह cytometer, रसायन विज्ञान विश्लेषक, और इस अध्ययन में प्रयुक्त डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर देखें ।

  1. Solubilize फ्लोरोसेंट-लेबल lyophilized कोलेस्ट्रॉल (1 mg, पूर्व/४९५ एनएम/507 एनएम) पाउडर में 1 मिलीलीटर १००% अल्कोहल.
  2. २,०४० x जी में 3 मिनट के लिए नमूना केंद्रापसारक और घुलनशील प्रतिदीप्ति युक्त supernatants का उपयोग करें-पट्टिका सरणी परख में कोलेस्ट्रॉल समुच्चय लेबल ।
    3. दवाओं की तैयारी के लिए
  3. , व्यक्तिगत रूप से solubilize पाउडर (2 मिलीग्राम) simvastatin, lovastatin, atorvastatin, ezetimibe, और ओमेगा-3 फैटी एसिड की 1 मिलीलीटर में १००% अल्कोहल ।
    4. २,०४० एक्स जी में 3 मिनट के लिए केंद्रापसारक के बाद
  4. , परख में दवाओं युक्त supernatants का उपयोग करें ।
  5. इसी तरह, solubilize व्यक्तिगत पाउडर (2 मिलीग्राम) के fluvastatin, rosuvastatin, नियासिन, और fibrate में 1 मिलीलीटर पानी की एक स्टॉक समाधान करने के लिए 2 मिलीग्राम/mL.
  6. २,०४० x जी में 3 मिनट के लिए केंद्रापसारक के बाद, पट्टिका सरणी परख में दवाओं युक्त supernatants का उपयोग करें ।
< p class = "jove_title" > 2. इन विट्रो में की जांच के लिए पट्टिका सरणी परख कोलेस्ट्रॉल कणों का गठन

  1. उपयोग रसायन विज्ञान विश्लेषक-1 (सामग्री की तालिका देखें) को कोलेस्ट्रॉल कणों के गठन के लिए पट्टिका सरणी परख स्थापित करने के लिए । एक गोल तल में परख प्रदर्शन, कम प्रोटीन बाध्यकारी ९६-अच्छी तरह से प्लेट 1 में तैयार एजेंट का उपयोग कर । २०० & #181 पर प्रत्येक कुआं में अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा बनाए रखें L और तपसिल. में सभी परख प्रदर्शन
    1. पहले, लोड १९४.५ & #181; प्रत्येक कुआं को फास्फेट बफर खारा (पंजाब) के एल.
    2. हर कुआं को जोड़ने के लिए, २.५ & #181; L (5 & #181; g) प्रत्येक लिपिड कम करने वाली दवा समाधान के लिए और 30 एस के लिए यह रसायन विज्ञान विश्लेषक-1 प्रतिक्रिया प्लेट पर रखकर एक समान रूप से समाधान में दवा मिश्रण द्वारा प्लेट हिला । कोई दवा नकारात्मक नियंत्रण नमूने के लिए जोड़ा जाता है ।
    3. तत, add 2 & #181; L (2 & #181; छ) फ्लोरोसेंट-लेबल कोलेस्ट्रॉल कुल प्रत्येक अच्छी तरह से हल करने के लिए और 30 एस के लिए प्लेट हिला रसायन विज्ञान विश्लेषक-1 प्रतिक्रिया प्लेट पर रखकर ।
    4. ३७ & #176 पर 2 ज सेट के लिए एक प्रयोगशाला शेखर पर थाली मशीन, सी और २०० rpm.
    5. के बाद, इमेजिंग प्रवाह cytometry.
      6. द्वारा कणों की छवियों का अधिग्रहण
< p class = "jove_title" > 3. इमेजिंग प्रवाह का उपयोग कोलेस्ट्रॉल कणों की छवियों पर कब्जा Cytometry

  1. सही साधन सेटिंग्स लोड करने के लिए डेटा प्राप्ति टेम्पलेट खोलें । Click & #34; फाइल & #34;, तब select & #34; ओपन टेम्पलेट & #8230; & #34; और टेम्पलेट फ़ाइल का चयन करें.
  2. Click & #34; फ्लश, लॉक, लोड & #34; नमूना लोडिंग के लिए साधन तैयार करने के लिए ।
  3. जब द & #34; लोड नमुना & #34; संवाद बॉक्स खुलता है, तो क्लिक करें & #34; ok & #34; लोड करने के लिए ५० & #181; L खंड 2 में तैयार किए गए प्रत्येक कुआं से नमूनों का इमेजिंग फ्लो cytometer.
  4. & #34; रन क | सेटअप & #34; वास्तविक समय में इमेजिंग क्षेत्र में कणों को देखने के लिए.
  5. जब इमेजिंग क्षेत्र में कण अच्छे फोकस में हों तो क्लिक करें & #34; रन | मोल & #34; प्रत्येक ऑब्जेक्ट की छवियों को एक साथ डार्क फील्ड (साइड स्कैटर/एसएससी), ब्राइट फील्ड (BF), ग्रीन प्रतिदीप्ति और येलो प्रतिदीप्ति के लिए एक उच्च-प्रवाह तरीके से प्राप्त करने के लिए ।
  6. दोहराएँ चरण ३.२-३.५ प्रत्येक नमूना से ५,०००-१०,००० कणों को प्राप्त करने के लिए.
  7. वस्तु प्रतिदीप्ति तीव्रता और रूपात्मक रूपांतरों का निर्धारण करने के लिए छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग सभी कच्चे छवि फ़ाइलों का विश्लेषण ।
    1. क्लिक करें & #34; tools & #34; बटन छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के शीर्ष पर, फिर चुनें & #34; बैच डाटा फाइल & #34; ड्राप-डाउन मेन्यू से, जो खुलेगा & #34; बैचों & #34; window.
    2. & #34; बैचेस & #34; विंडो, क्लिक करें & #34; जोड़ें बैच & #34; बटन, जो खुलेगा & #34;D efine एक बैच & #34; window.
    3. & #34;D efine a बैच & #34; विंडो, क्लिक करें & #34; फ़ाइलें जोड़ें & #34; बटन और raw छवि फ़ाइलों का चयन करें, & #34; टेम्पलेट & #34; बटन और उपयुक्त डेटा विश्लेषण टेम्पलेट फ़ाइल चुनें, फिर चयन & #34; OK & #34; और & #34; Submit बैचेस & #34; प्रसंस्करण और रॉ छवि फ़ाइलों का विश्लेषण शुरू करने के लिए ।
< p class = "jove_title" > 4. पट्टिका सरणी परख लिपिड के मूल्यांकन के आधार पर शुद्ध कोलेस्ट्रॉल कणों पर प्रभाव कम है

  1. चरण २.१ में वर्णित के रूप में, कोलेस्ट्रॉल कणों का गठन शुद्ध VLDL, एलडीएल, और एचडीएल लिपो कणों का उपयोग परख प्रदर्शन/ एक ९६-अच्छी तरह से थाली में पट्टिका सरणी परख करते हैं ।
    1. सबसे पहले, पंजाबियों के साथ सभी कुओं का भार; एक २०० & #181 का उपयोग करें; L एक अच्छी तरह के लिए अंतिम मात्रा.
  2. नकारात्मक नियंत्रण के लिए, जोड़ें 4 & #181; जी VLDL, एलडीएल, या एचडीएल प्रोटीन/कणों व्यक्तिगत रूप से एक अच्छी तरह से दवाओं के बिना और 30 एस के लिए थाली हिला लिपिड कम दवा प्रभाव की जांच के लिए
    1. , जोड़ 4 & #181; जी VLDL, एलडीएल, या एचडीएल प्रोटीन/कणों को व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक अच्छी तरह से और 30 एस के लिए प्लेट हिला
      2. कुओं के लिए
    2. 4 & #181 के साथ जोड़ा गया; g VLDL, एलडीएल, या एचडीएल, add २.५ & #181; L (5 & #181; g) ezetimibe, lovastatin, simvastatin, या नियासिन समाधान और 30 एस के लिए प्लेट हिलाकर इसे केमिस्ट्री विश्लेषक-1 में रखकर शेक करें.
    3. तत, add 2 & #181; L (2 & #181; छ) प्रतिदीप्ति-लेबल कोलेस्ट्रॉल कुल सभी कुओं के लिए समाधान और 30 एस के लिए यह रसायन विज्ञान विश्लेषक-1 प्रतिक्रिया प्लेट पर रखकर प्लेट हिला ।
  3. एक लैब शेखर में 2 ज के लिए थाली ३७ & #176 पर सेट; सी और २०० आरपीएम.
  4. चरण ३.१-३.५ के बाद इमेजिंग प्रवाह cytometry का उपयोग कर नमूने प्राप्त करें ।
  5. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर रॉ छवि फ़ाइलों का विश्लेषण के रूप में ३.७ कदम में वर्णित है ।
  6. विश्लेषण टेम्पलेट में, कोलेस्ट्रॉल कण उपजनसंख्याों की पहचान के लिए निम्न गेटिंग योजना का उपयोग करें.
    1. ग्रीन चैनल के एक भूखंड पर संतृप्त पिक्सेल गिनती (x-अक्ष) और डार्क फील्ड चैनल संतृप्त पिक्सेल गिनती (y-अक्ष), या तो चैनल में एक या अधिक संतृप्त पिक्सल के साथ वस्तुओं को अस्वीकार.
    2. साजिश ग्रीन चैनल तीव्रता (x-अक्ष) और एसएससी तीव्रता (y-अक्ष) का उपयोग कर संतृप्त पिक्सल के बिना वस्तुओं के कण: वस्तुओं अपने ग्रीन चैनल और एसएससी के आधार पर तीन क्षेत्रों (VLDL, एलडीएल, एचडीएल) के एक में आते हैं ।
      नोट: इन गेट्स नियंत्रण प्रयोगों से उत्पंन डेटा के आधार पर बनाया गया शुद्ध VLDL, एलडीएल, और एचडीएल कणों का उपयोग/
  7. प्रत्येक नमूने के लिए लिपिड कम दवा प्रभाव का निर्धारण करने के लिए, कुल लिपोप्रोटीन कणों सांद्रता की गणना, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रत्येक उपजनसंख्या का प्रतिशत (VLDL, एलडीएल, एचडीएल) चरण ६.५ में वर्णित के रूप में.
    1. निम्नलिखित समीकरण का उपयोग कण सांद्रता (कणों/एमएल) की गणना:
      < img alt = "समीकरण" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56596/56596eq1.jpg"/>
      नोट: VLDL डॉट में गेटिंग, एलडीएल, और एचडीएल प्रतिदीप्ति क्षेत्रों-साजिश का पता लगाने ~ उनके संबंधित उपआबादी का ८०%, और शेष ~ कणों के 20% अंय गेटिंग क्षेत्रों के साथ ओवरलैप ।
< p class = "jove_title" > 5. सीरम नमूनों में लिपिड सांद्रता का मापन

  1. एलडीएल, एचडीएल, कोलेस्ट्रॉल, और ट्राइग्लिसराइड्स के रसायन विज्ञान विश्लेषक-2 के द्वारा निर्धारित करने के लिए, सीरम नमूनों का उपयोग करने के लिए आयु-मिलान सामान्य और डिसलिपिडेमिया विषयों से प्राप्त.
  2. एलडीएल, एचडीएल, कोलेस्ट्रॉल की असामान्य एकाग्रता को परिभाषित, और ट्राइग्लिसराइड्स सीरम नमूनों में ऊपरी और निचले संदर्भ मूल्यों से परे की पहचान की उनकी एकाग्रता के आधार पर.
  3. सामांय संदर्भ मान का पालन करें recommended रिएजेंट निर्माता द्वारा: कोलेस्ट्रॉल (4-200 मिलीग्राम/dl), एचडीएल (३.०-६५ mg/dl), एलडीएल (4-100 mg/dl), और ट्राइग्लिसराइड्स (9-200 mg/
    4. )
  4. सीरम नमूने है कि या तो कम संदर्भ मूल्य या कोलेस्ट्रॉल और ट्राइग्लिसराइड्स के लिए उच्च संदर्भ मूल्य से ऊपर के रूप में एक असामान्य मूल्य है की पहचान, और उपस्थिति और लिपिड कम दवाओं की अनुपस्थिति में स्क्रीनिंग के लिए उन्हें का उपयोग करें.
< p class = "jove_title" > 6. सीरम नमूनों में कोलेस्ट्रॉल कणों के गठन पर दवाओं के प्रभाव का विश्लेषण

  1. सीरम नमूने में कोलेस्ट्रॉल कणों के गठन के लिए पट्टिका सरणी परख स्थापित करने के लिए रसायन विज्ञान विश्लेषक-1 का उपयोग करें । एक गोल तल में परख प्रदर्शन, कम प्रोटीन बाध्यकारी ९६-अच्छी तरह से थाली । २०० & #181 की अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा का प्रयोग करें; L/ठीक है और तपसिल.
    2. में सभी परख प्रदर्शन
  2. एक stepwise तरीके से रिएजेंट लोड करके प्लेट तैयार करते हैं ।
    1. कंट्रोल वेल्स तैयार करते हैं.
    2. लोड १९३ & #181; प्रत्येक वेल को पंजाबियों के एल.
    3. जोड़ें २.५% (v/v) रोगी सीरम (केवल एक सीरम नमूना प्रति अच्छी तरह से) और यह रसायन विज्ञान विश्लेषक प्रतिक्रिया प्लेट पर रखकर 30 एस के लिए थाली हिला ।
    4. Add 2 & #181; L (2 & #181; g) के प्रतिदीप्ति-लेबल कोलेस्ट्रॉल समग्र समाधान में एक अच्छी तरह से और एक रसायन विश्लेषक-1 प्रतिक्रिया प्लेट पर रखकर 30 एस के लिए थाली हिला ।
  3. औषधियों से कुएँ तैयार करते हैं.
    1. लोड १९१ & #181; प्रत्येक वेल को पंजाबियों का एल.
    2. जोड़ें २.५% (v/v) रोगी सीरम (केवल एक सीरम नमूना प्रति अच्छी तरह से) और एक रसायन विश्लेषक-1 प्रतिक्रिया प्लेट पर रखकर 30 एस के लिए थाली हिला ।
    3. Add 2 & #181; L ezetimibe, lovastatin, simvastatin या नियासिन समाधान (4 & #181; g) सभी कुओं को छोड़कर नकारात्मक नियंत्रण कुओं. अच्छी तरह से प्रति केवल एक दवा जोड़ें और एक रसायन विश्लेषक-1 रिएक्शन प्लेट पर रखकर 30 एस के लिए थाली हिला ।
    4. Add 2 & #181; प्रतिदीप्ति के एल-लेबल कोलेस्ट्रॉल कुल समाधान (2 & #181; g) में प्रत्येक अच्छी तरह से और 30 एस के लिए प्लेट हिला रसायन विज्ञान विश्लेषक-1 प्रतिक्रिया प्लेट पर रखकर ।
  4. लोड दवाओं के बाद ही सभी कुओं (नियंत्रण और दवा का इलाज) उनके संबंधित सीरम के नमूनों के साथ लोड किया गया है, और इस कदम के अंत में प्रतिदीप्ति-लेबल कोलेस्ट्रॉल जोड़ें.
  5. एक प्रयोगशाला में ३७ & #176 पर सेट शेखर में 2 ज के लिए थाली मशीन, सी और २०० rpm ।
  6. चरण ३.१-३.६ में वर्णित निम्न सेटिंग्स इमेजिंग प्रवाह cytometer द्वारा नमूने प्राप्त करें ।
  7. चरण ३.७ में वर्णित के रूप में एक ही टेम्पलेट का उपयोग कर सभी छवि फ़ाइलें संसाधित बैच के लिए छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें ।
    1. चरण ४.५ और ४.६ में वर्णित के रूप में प्लॉट पर गेट्स आरेखण द्वारा डेटा विश्लेषण निष्पादित करें ।
  8. लिपिड कम दवा प्रभाव का निर्धारण करने के लिए/प्रतिक्रिया (कम, मध्यम, और उच्च) प्रत्येक नमूने के लिए, कुल लिपोप्रोटीन कण एकाग्रता की गणना, साथ ही कुल कणों का प्रतिशत VLDL के शामिल, एलडीएल, और एचडीएल उपलोकसंख्या.
  9. प्लाट द VLDL, एलडीएल, और एक वस्तु के हिस्टोग्राम पर एचडीएल आबादी & #39; एस उज्ज्वल क्षेत्र छवि, लंबाई से घटाई चौड़ाई (लंबाई-चौड़ाई), और या तो गोलाकार या रैखिक क्षेत्रों में फाटक: (लंबाई चौड़ाई) के साथ वस्तुओं & #8804; 2 & #160; & #181; मीटर में गिरावट गोलाकार और रैखिक आकार का कणों का प्रतिशत की गणना के लिए गोलाकार क्षेत्र.
  10. गोलाकार और रैखिक आकार का एलडीएल और एचडीएल कोलेस्ट्रॉल प्रत्येक सीरम नमूना के साथ और प्रत्येक दवा के बिना के लिए पहचाने कणों का प्रतिशत की तुलना करें । प्रत्येक सीरम नमूने के लिए प्राप्त तपसिल मानों के बीच, गोलाकार और रैखिक आकार का एलडीएल और एचडीएल कणों कि एसडी & #177 के भीतर गिर का प्रतिशत स्वीकार करते हैं; दवा प्रभाव के निर्धारण के लिए 2 रेंज.

Representative Results

पट्टिका सरणी परख लिपिड के विश्लेषण के आधार पर कोलेस्ट्रॉल कणों के गठन पर दवा प्रभाव कम:

कोलेस्ट्रॉल कणों का मॉडुलन आकृति विज्ञान में statins के प्रभाव के मूल्यांकन के लिए, फ्लोरोसेंट लेबल कोलेस्ट्रॉल समुच्चय व्यक्तिगत lovastatin, simvastatin, atorvastatin, rosuvastatin, और बफर में fluvastatin के साथ मशीन थे । ये सभी नमूने चित्रा 1 और चित्रा 2में दिखाए गए अनुसार आकृति विज्ञान विश्लेषण के लिए कोलेस्ट्रॉल कणों की छवियों पर कब्जा करने के लिए इमेजिंग फ्लो cytometry का उपयोग कर अधिग्रहीत किया गया था. दिलचस्प है, बफर में कोलेस्ट्रॉल कणों के गठन पर दवा प्रभाव का विश्लेषण संकेत दिया कि lovastatin, simvastatin, और atorvastatin विभिंन आकारों और आकार प्रदर्शित कोलेस्ट्रॉल कणों की एक विषम जनसंख्या के गठन के लिए प्रेरित, चित्र 3 ए -सी. इसके विपरीत, rosuvastatin, fluvastatin, और नकारात्मक नियंत्रण (दवा के बिना) की उपस्थिति में गठित कोलेस्ट्रॉल कणों आकार में सजातीय थे और आकृति विज्ञान के रूप में चित्रा 3d-fमें दिखाया गया है । इसके अलावा, यह देखा गया था कि lovastatin, simvastatin, और atorvastatin कोलेस्ट्रॉल दोनों गोलाकार और रैखिक किनारा morphologies प्रदर्शन कणों के गठन प्रेरित, जबकि rosuvastatin और fluvastatin कोलेस्ट्रॉल के गठन प्रेरित केवल गोलाकार आकृति विज्ञान के साथ कणों. रैखिक किस्में गठन उत्प्रेरण पर statins प्रभाव lovastatin के लिए 16% के क्रम में पाया गया था, simvastatin के लिए 2%, और atorvastatin के लिए ०.२%.

आगे के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए लिपिड कम कणों गठन पर दवाओं, फ्लोरोसेंट लेबल कोलेस्ट्रॉल समुच्चय व्यक्तिगत रूप से ezetimibe, fibrate, नियासिन, और ओमेगा-3 फैटी एसिड के साथ मशीन थे. के रूप में statins के साथ मनाया, इन दवाओं विषम आकारों और आकार के रूप में चित्र 4a-डीमें प्रदर्शित के साथ कोलेस्ट्रॉल कणों के गठन प्रेरित किया । उनमें से, ezetimibe कोलेस्ट्रॉल दोनों गोलाकार और रैखिक किनारा morphologies जबकि fibrate, नियासिन, और ओमेगा-3 फैटी एसिड का प्रदर्शन कणों के गठन प्रेरित केवल गोलाकार के आकार का कोलेस्ट्रॉल कणों के गठन प्रेरित किया । तदनुसार, रैखिक किनारा कोलेस्ट्रॉल कणों के गठन के आकार पर दवाओं के प्रभाव ezetimibe के लिए 3% के क्रम में था, 0% fibrate के लिए, 0% नियासिन के लिए, और 0% ओमेगा-3 फैटी एसिड के लिए ।

रूपात्मक विश्लेषण प्रत्येक गोलाकार या रैखिक किनारा कोलेस्ट्रॉल कण के आकार का पता चला कई छोटे एक साथ जुड़े कणों से बना है । फ्लोरोसेंट सकारात्मक गोलाकार कोलेस्ट्रॉल कणों की पहचान के आकार ~ 2-30µm2 की सीमा में हैं, जबकि रैखिक आकार का कण के आकार ~ 2-60 µm 2 की सीमा में हैं ।

शुद्ध VLDL और एलडीएल कणों पर लिपिड कम दवाओं के प्रभाव का विश्लेषण:

आगे लिपो की उपस्थिति में कोलेस्ट्रॉल कणों के गठन की जांच करने के लिए, फ्लोरोसेंट लेबल कोलेस्ट्रॉल समुच्चय व्यक्तिगत रूप से शुद्ध VLDL, एलडीएल, और एचडीएल प्रोटीन के साथ मशीन थे/ परिणाम दिखाया, एलडीएल और एचडीएल कणों के साथ गर्मी की तुलना में, कि कोलेस्ट्रॉल समुच्चय VLDL प्रोटीन के साथ मशीन कोलेस्ट्रॉल कणों की एक उच्च संख्या के गठन का कारण बना, चित्रा 5. इसके अलावा, दो कोलेस्ट्रॉल कणों के प्रमुख अंश VLDL आबादी में देखा गया एक एलडीएल अंश में फ्लोरोसेंट के साथ मशीन के दौरान अपने आंशिक परिवर्तन का सुझाव-कोलेस्ट्रॉल समुच्चय लेबल । कणों की छवि विश्लेषण दोनों गोलाकार (~ ९७%) और रैखिक आकार (~ 3%) VLDL, एलडीएल, और एचडीएल आबादी के बीच कणों की उपस्थिति का संकेत दिया । गोलाकार कणों की आकार पर्वतमाला है ~ 2-30µm2, रैखिक कणों की आकार पर्वतमाला रहे हैं, जबकि ~ 2-60 µm 2.

की जांच के लिए लिपिड कम शुद्ध कणों पर दवा प्रभाव, VLDL और एलडीएल कणों व्यक्तिगत रूप से ezetimibe, lovastatin, simvastatin, और नियासिन के साथ मशीन थे । एक परिणाम के रूप में, दवा के बिना प्रयोगों पर नियंत्रण की तुलना में, दवा प्रभाव VLDL कणों गठन पर मनाया ezetimibe, simvastatin, lovastatin, और नियासिन में उच्च था. एलडीएल दवाओं के साथ मशीन कणों एक प्रमुख एकल अंश दिखाई दिया और कणों के गठन पर दवा प्रेरित प्रभाव ezetimibe, simvastatin, lovastatin में उच्च था, और नियासिन, चित्रा 6.

लिपिड के रूपांतरों-कम करने दवा प्रभाव सीरम नमूनों में कोलेस्ट्रॉल कणों के वितरण को बदलने में:

पूर्ववर्ती प्रयोगों दवा प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए शुद्ध लिपो के साथ बफर समाधान में प्रदर्शन किया गया. इसलिए, अगले चरण में, कोलेस्ट्रॉल कणों के गठन पर लिपिड कम दवाओं की प्रभावशीलता डिसलिपिडेमिया और 25 आयु-मिलान सामान्य विषयों के साथ 25 विषयों से एकत्र ५० सीरम नमूनों का उपयोग कर जांच की गई. प्रत्येक सीरम नमूने में दवा की प्रतिक्रिया उपस्थिति और दवाओं की अनुपस्थिति में कोलेस्ट्रॉल कणों के गठन के प्रोफ़ाइल में परिवर्तन के आधार पर मापा गया था. पट्टिका सरणी परख में, प्रत्येक सीरम नमूना ezetimibe, lovastatin, simvastatin, और नियासिन दवाओं के खिलाफ जांच की थी । परिणाम VLDL, एलडीएल, और सीरम नमूनों में एचडीएल कणों का वितरण मॉडुलन में इन दवाओं के बीच असमानता का पता चला, एलडीएल को कम करने और एचडीएल कोलेस्ट्रॉल कणों के गठन में वृद्धि पर विशेष रूप से उनके प्रभाव । लिपिड कम करने की दवाओं के लिए अद्वितीय प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन डिसलिपिडेमिया सीरम नमूने के तीन प्रतिनिधियों चित्रा 7में दिखाया गया है ।

सीरम व्युत्पन्न एलडीएल और एचडीएल कोलेस्ट्रॉल कणों का नियमन आकृति विज्ञान पर दवा प्रभाव की पहचान:

सीरम व्युत्पंन कोलेस्ट्रॉल कणों के phenotype विश्लेषण दोनों रैखिक किस्में और गोलाकार के आकार का VLDL, एलडीएल, और एचडीएल उप जनसंख्या की उपस्थिति का पता चला, इस प्रकार की पुष्टि एक समान आकृति विज्ञान दोनों बफर में किया प्रयोगों में पहचाना और शुद्ध लिपोप्रोटीन कणों के साथ के रूप में चित्रा 8में दिखाया गया है । हालांकि, गोलाकार और रैखिक आकार कोलेस्ट्रॉल कणों का वितरण व्यापक रूप से डिसलिपिडेमिया और उंर के बीच विविध-सामांय विषयों मिलान । विशेष रूप से, नियंत्रण परख दवाओं के बिना प्रदर्शन रैखिक डिसलिपिडेमिया के बीच एलडीएल कोलेस्ट्रॉल कणों के आकार का वितरण में अंतर दिखाया (२.०%) और उंर से मिलान सामांय (मतलब १.३%) सीरम नमूनों की । इसी प्रकार, रैखिक किनारा का एक बढ़ा स्तर एचडीएल कोलेस्ट्रॉल कणों के आकार का डिसलिपिडेमिया नमूनों में मनाया गया था (मतलब १८.३%) के आयु-मिलान की तुलना में (माध्य ११.१%) सीरम नमूने । सहसंबंध में, परख डिसलिपिडेमिया सीरम के नमूनों में दवाओं की उपस्थिति में प्रदर्शन किया simvastatin के लिए रैखिक के आकार का एचडीएल कोलेस्ट्रॉल कणों के गठन में एक उल्लेखनीय कमी दिखाया (८.३%), ezetimibe (११.५ का मतलब%), lovastatin (११.७ का मतलब%), और नियासिन के लिए कोई कटौती (१८.३%) का मतलब है । इसके अलावा, रैखिक आकार का एलडीएल कोलेस्ट्रॉल कणों के गठन में कमी डिसलिपिडेमिया सीरम नमूनों में मनाया गया था जब तालिका 1में प्रदर्शित दवाओं के साथ मशीन ।

इसके अलावा, परख उंर में दवाओं की उपस्थिति में प्रदर्शन-मिलान नियंत्रण सीरम साैंपles simvastatin में रैखिक के आकार का एचडीएल कोलेस्ट्रॉल कणों में उल्लेखनीय कमी दिखाया (५.०%), ezetimibe (मतलब ८.२%), lovastatin (मतलब ८.७%), और नियासिन (मतलब १०.८%) के रूप में तालिका 2में दिखाया गया है । दोनों डिसलिपिडेमिया और उंर मिलान सामांय सीरम नमूने रैखिक आकार का एलडीएल और एचडीएल कोलेस्ट्रॉल कणों में दवा प्रेरित कमी का प्रदर्शन गोलाकार के आकार का कोलेस्ट्रॉल कणों में एक रिश्तेदार वृद्धि दिखाई (डेटा नहीं दिखाया गया है) ।

Figure 1
चित्र 1: आरेख के इन विट्रो में की प्रक्रिया illustrating कोलेस्ट्रॉल कणों आकृति विज्ञान । (a, b) बफर या सीरम नमूनों में लिपिड कम दवा के अलावा. (ग) नमूनों के लिए प्रतिदीप्ति-लेबल घुलनशील कोलेस्ट्रॉल समुच्चय के अलावा । (d) इमेजिंग फ़्लो cytometry का उपयोग करके अघुलनशील कोलेस्ट्रॉल कणों के रूपात्मक विश्लेषण के लिए परिणामी नमूने प्राप्त करना । स्केल बार्स = 10 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: इमेजिंग प्रवाह cytometry का उपयोग कर कोलेस्ट्रॉल कणों के दो अलग morphologies की पहचान. (क) कण उज्ज्वल क्षेत्र छवियों के textural विश्लेषण के आधार पर रैखिक या गोलाकार आबादी में अलग कर रहे हैं । विशेष रूप से, डॉट-भूखंड का मतलब एच सजातीयता (x-अक्ष) और माध्य h एन्ट्रापी (y-अक्ष) का पता लगाने के लिए दो gated क्षेत्र होते हैं गोलाकार (लाल) और रेखीय किनारा आकार का (नीला) कोलेस्ट्रॉल कणों. (b) 1 जनसंख्या में पहचाने गए गोलाकार आकार के कणों की आकृति विज्ञान प्रदर्शित करने वाली छवियां । (ग) जनसंख्या 2 में रेखीय किनारा आकार के कणों की पहचान की छवियां । (d) हिस्टोग्राम सभी फ्लोरोसेंट सकारात्मक कोलेस्ट्रॉल कणों के वितरण को प्रदर्शित करने के लिए उनकी एकाग्रता और उपजनसंख्या निर्धारित करते थे । स्केल बार्स = 10 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: छवि दीर्घाओं कोलेस्ट्रॉल कणों गठन नियमन में statins के प्रभाव को प्रदर्शित. उज्ज्वल क्षेत्र पारंपरिक प्रवाह cytometer में FSC के समान क्षेत्र को संदर्भित करता है । ग्रीन चैनल ५०५-५६० एनएम में पाया प्रतिदीप्ति उत्सर्जन को संदर्भित करता है, और पीले चैनल 560-595 एनएम में पाया प्रतिदीप्ति उत्सर्जन को संदर्भित करता है । (a-e) छवि दीर्घाओं lovastatin, simvastatin, atorvastatin, rosuvastatin, और fluvastatin, क्रमशः की उपस्थिति में गठित कोलेस्ट्रॉल कणों की आकृति विज्ञान प्रदर्शित । (च) statin (ऋणात्मक नियंत्रण) के अभाव में कोलेस्ट्रॉल कणों का निर्माण होता है. स्केल बार्स = 10 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: कोलेस्ट्रॉल कणों गठन मॉडुलन में लिपिड कम करने दवाओं के अंतर प्रभाव का प्रदर्शन. (a-d) ezetimibe, नियासिन, fibrate, और ओमेगा-3 फैटी एसिड की उपस्थिति में गठित कोलेस्ट्रॉल कणों की आकृति विज्ञान प्रदर्शित छवि दीर्घाओं क्रमशः । ग्रीन चैनल ५०५-५६० एनएम में पाया प्रतिदीप्ति उत्सर्जन को संदर्भित करता है, और पीले चैनल 560-595 एनएम में पाया प्रतिदीप्ति उत्सर्जन को संदर्भित करता है । स्केल बार्स = 10 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: VLDL का विश्लेषण, एलडीएल, और एचडीएल कोलेस्ट्रॉल कणों का गठन दवा के अभाव में । डॉट-भूखंड: एक्स-अक्ष के एक स्पेक्ट्रम प्रदर्शित करता है कोलेस्ट्रॉल कणों का पता चला में ग्रीन प्रतिदीप्ति चैनल (५०५-५६० एनएम) और Y-अक्ष प्रदर्शित करता है पक्ष तितर बितर । गेटिंग VLDL, एलडीएल के क्षेत्रों से पता चलता है, और एचडीएल प्रतिदीप्ति डॉट-भूखंड में पाया कणों । (क) शुद्ध VLDL की उपस्थिति में कोलेस्ट्रॉल कणों का गठन. (ख) VLDL कणों की प्रतिनिधि छवियां । (ग) शुद्ध एलडीएल की उपस्थिति में कोलेस्ट्रॉल कणों का गठन । (d) एलडीएल कणों का प्रतिनिधि छवियां । (ङ) शुद्ध एचडीएल की उपस्थिति में कोलेस्ट्रॉल कणों का गठन । (च) एचडीएल कणों की प्रतिनिधि छवियां । स्केल बार्स = 10 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: शुद्ध VLDL और एलडीएल कोलेस्ट्रॉल कणों पर लिपिड कम दवाओं के प्रभाव का प्रदर्शन. (क) दवा के बिना VLDL कण । (ख) VLDL कणों ezetimibe के साथ मशीन । (ग) VLDL कणों lovastatin के साथ मशीन । (घ) VLDL कणों simvastatin के साथ मशीन । (ई) नियासिन के साथ VLDL कणों की मशीन । (च) एलडीएल कणों की दवा के बिना मशीन । (छ) एलडीएल कणों ezetimibe के साथ मशीन । (ज) एलडीएल lovastatin के साथ मशीन कणों । (i) एलडीएल simvastatin के साथ मशीन कणों । (जंमू) एलडीएल कणों के साथ नियासिन की मशीन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: प्रतिदीप्ति डॉट-भूखंडों VLDL, एलडीएल, और एचडीएल कोलेस्ट्रॉल कणों में सीरम नमूने गठन में लिपिड कम दवाओं का अंतर दिखा । शीर्ष पंक्ति, सीरम 1 की स्क्रीनिंग 0 से 15% एचडीएल कणों गठन में वृद्धि में निम्न स्तर की दवा प्रतिक्रिया दिखा रहा है; मध्य पंक्ति, सीरम 2 की स्क्रीनिंग 16 से ५०% एचडीएल कणों को बढ़ाने में मध्यम स्तर की दवा प्रतिक्रिया दिखा रहा है; नीचे पंक्ति, सीरम 3 की स्क्रीनिंग ५१ १००% एचडीएल कणों को बढ़ाने में उच्च स्तर दवा प्रतिक्रिया दिखा । (a, f, k) दवाओं के बिना सीरम नमूने । (b, g, l) सीरम ezetimibe के साथ मशीन के नमूने । (c, h, m) सीरम lovastatin के साथ मशीन के नमूने । (d, i, n) सीरम simvastatin के साथ मशीन के नमूने । (ई, जे, ओ) सीरम नमूने नियासिन के साथ मशीन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्रा 8: सीरम नमूना 1 में पहचाना कोलेस्ट्रॉल कणों की आकृति विज्ञान प्रदर्शित छवि दीर्घाओं. ग्रीन चैनल कणों से प्रतिदीप्ति उत्सर्जन की छवियों को दिखाता है; साइड स्कैटर (सियान चैनल) कणों द्वारा बिखरे उत्तेजना लेजर प्रकाश की छवियों से पता चलता है. (क) गोलाकार और रैखिक आकार की दवा के बिना गठन कोलेस्ट्रॉल कणों । (b, c, d, e) कोलेस्ट्रॉल कणों क्रमशः ezetimibe, lovastatin, simvastatin, और नियासिन की उपस्थिति में गठन किया । स्केल बार्स= 10 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

सीरम आईडी बिना दवा (नियंत्रण) Ezetimibe के साथ Lovastatin के साथ Simvastatin के साथ नियासिन के साथ
रैखिक%, एलडीएल कणों % रैखिक, एचडीएल कण रैखिक%, एलडीएल कणों % रैखिक, एचडीएल कण रैखिक%, एलडीएल कणों % रैखिक, एचडीएल कण रैखिक%, एलडीएल कणों % रैखिक, एचडीएल कण रैखिक%, एलडीएल कणों % रैखिक, एचडीएल कण
PNDS-01 १.७३ ४५.२ ०.८१ १८.१ ०.६१ १६.१ ०.५९ १३.९ २.२६ ३३.६
PNDS-02 २.८६ ३५.९ १.२६ ३०.९ १.२७ २२.७ ०.७३ १५.२ ३.०३ ३७.७
PNDS-03 २.०४ ३५.८ ०.८७ ४.८२ १.०२ ४.१४ ०.३६ ३.०६ ०.४५ ९.५७
PNDS-04 २.५६ ३२.९ १.१५ २१.८ १.१२ १८.६ ०.७७ १७.२ ३.३७ ३६.५
PNDS-05 ०.४२ २९.२ ०.२४ ५.६२ ०.२२ ८.७२ ०.१६ ९.९१ ०.३५ २२.२
PNDS-06 १.८ २८.१ ०.४ १६.८ ०.६२ 15 ०.४२ ९.२७ २.२८ ३८.४
PNDS-07 १.८ २६.५ ०.८५ १०.५ १.१८ १९.९ ०.६२ ७.३२ १.२९ २३.४
PNDS-08 ०.९८ २२.८ ०.८६ ७.२८ १.५५ १०.२ ०.१४ ५.९८ ०.५९ १३.३
PNDS-09 ३.८७ २२.१ १.९८ ९.५६ १.८७ १०.३ १.४६ ७.९६ २.८६ ९.८८
PNDS-10 ४.४६ २१.९ २.५७ १३.६ ४.०४ १७.१ २.२८ ११.९ ०.७१ २५.७
PNDS-11 १.५७ १९.२ १.१५ ९.२४ १.३७ ६.९८ ०.७४ ५.०३ १.३७ 16
PNDS-12 १.०६ १६.७ ०.६६ ४.३८ ०.७ ४.७४ ०.९९ ६.३६ १.१४ ४.७३
PNDS-13 ४.८५ १६.६ १.२८ ३०.४ १.४ ३२.६ ०.८ १६.६ ४.०२ 31
PNDS-14 २.०८ 16 ०.६८ १५.४ ०.६४ १६.५ १.९७ १०.२ १.२५ २०.११
PNDS-15 १.५ ११.९ १.१४ १३.३ १.२१ ११.४ ०.८ ६.१२ १.३८ ४.५९
PNDS-16 १.८२ १०.४ २.०४ ९.५९ १.२४ ५.६२ ०.९१ ५.३८ १.३१ ७.६१
PNDS-17 १.०५ १०.३ १.०२ ४.७ १.७८ १५.१ ०.९३ ७.८१ १.२७ 13
PNDS-18 १.११ ८.७६ ०.५४ ३.६८ ०.६१ ३.५१ १.०१ ५.०३ १.०२ ६.६९
PNDS-19 1 ८.५२ ०.७५ ६.६७ ०.७६ ५.८६ ०.९१ ८.३६ १.२२ ११.९
PNDS-20 ३.५४ ७.९२ ३.७८ 12 ३.५६ ५.८१ ३.२८ ८.२८ ३.४४ १२.३
PNDS-21 १.८८ ७.६९ २.१२ ११.४ १.७३ ९.५४ १.७७ ८.३४ २.३२ १६.७
PNDS-22 १.६४ ७.१७ ०.३५ ५.७५ ०.५६ १३.२ ०.१४ ४.३३ १.२३ १७.८
PNDS-23 १.५४ ६.२७ १.२५ ७.२४ १.०२ ६.१२ ०.७३ ३.५८ १.४२ ६.६९
PNDS-24 ०.५३ ६.२२ ०.५२ ४.४९ ०.९१ ५.५७ ०.५४ ४.०१ ०.६५ १०.५
PNDS-25 २.९७ ५.१ १.५९ 11 १.८८ 9 १.०३ ६.५४ २.६१ २९.१

तालिका 1: पट्टिका सरणी परख में डिसलिपिडेमिया सीरम नमूनों की स्क्रीनिंग लिपिड कम दवाओं के अंतर प्रभाव दिखाते हैं । दवा के बिना नियंत्रण की तुलना में (कॉलम 2, 3), ezetimibe के साथ मशीन सीरम नमूनों (कॉलम 4, 5), lovastatin (कॉलम 6, 7), simvastatin (कॉलम 8, 9), और नियासिन (कॉलम 10, 11) रैखिक के आकार का एलडीएल और एचडीएल कोलेस्ट्रॉल उत्प्रेरण पर रूपांतरों दिखाया कणों का गठन ।

सीरम आईडी बिना दवा Ezetimibe के साथ Lovastatin के साथ Simvastatin के साथ नियासिन के साथ
रैखिक%, एलडीएल कणों % रैखिक, एचडीएल कण रैखिक%, एलडीएल कणों % रैखिक, एचडीएल कण रैखिक%, एलडीएल कणों % रैखिक, एचडीएल कण रैखिक%, एलडीएल कणों % रैखिक, एचडीएल कण रैखिक%, एलडीएल कणों % रैखिक, एचडीएल कण
PNAN-01 २.०५ २६.८ ०.६२ ११.९ ०.५६ १६.९ ०.५२ ९.२८ १.४ ११.९
PNAN-02 १.३५ २६.३ १.६८ २१.८ २.५९ २३.६ ०.७९ ६.९२ २.१६ २९.७
PNAN-03 २.४
२४.९ ०.५३ ७.५४ ०.५७ १३.८ ०.५५ ५.८२ १.७ ४.७१ PNAN-04 १.९९ २१.५ १.५४ ९.४५ १.५६ ८.२५ ०.३१ ३.७४ २.८८ २०.८ PNAN-05 १.७७ १८.८ १.४९ ६.०३ १.६५ ५.५ ०.५४ ४.६७ १.२ ८.१९ PNAN-06 १.१२ १५.२ ०.६७ ४.४२ २.६८ १३.३ ०.५ २.३७ १.५४ १६.३ PNAN-07 १.०३ १४.४ ०.७९ ६.८३ १.४५ ७.९१ ०.६७ ५.३६ १.५७ 12 PNAN-08 ०.९८ १४.३ ०.८८ ४.४८ 2 ७.१ ०.१९ २.६६ १.०२ १८.१ PNAN-09 २.८५ १४.१ १.९५ १२.६ २.३४ १२.५ ०.७ ६.२४ १.८४ १८.७ PNAN10 १.०१ १०.४ ०.८ ५.०७ ०.५१ ५.९ ०.८७ ६.५ १.६३ १०.९ PNAN-11 ०.९२ १२.४ ०.२१ ९.९४ ०.२९ ३.३१ ०.२९ ६.५२ ०.५८ १०.४ PNAN-12 ०.६ १०.५ ०.५६ ५.७८ १.०६ ४.७४ ०.४ ३.३२ ०.९१ ११.८ PNAN-13 १.२५ १०.३ ०.४५ ३.७९ ०.६७ ६.५३ ०.२७ ३.१७ ०.८ ६.२८ PNAN-14 १.०३ ९.८६ १.१२ ८.५१ १.०५ ६.९१ ०.६ ५.९४ १.०५ ८.१४ PNAN-15 २.२८ ८.१ १.९३ १०.४ २.१४ ८.८६ १.५६ ६.८४ २.३१ ८.६१ PNAN-16 १.९८ ७.६९ ०.४५ ४.३६ 1 ५.४६ ०.२७ २.८९ ०.४९ ४.१२ PNAN-17 १.७२ ६.७२ ०.७५ १४.८ ०.७४ ९.२६ ०.४९ ५.५८ १.९८ १२.८ PNAN-18 २.४५ ६.३८ ०.८५ १६.८ ०.८९ १४.२ ०.५८ ५.९ १.८ २०.६ PNAN-19 १.६७ ५.१२ ०.५८ ८.६३ ०.६५ ५.७ ०.६४ ८.८ १.८८ २.०८ PNAN-20 १.१७ ४.४१ ०.८५ ७.७७ ०.९१ ६.४३ ०.६९ ५.०८ १.२१ ६.१२ PNAN-21 ०.३१ ४.१८ ०.४८ ६.९५ ०.१९ ५.०९ ०.१५ २.१ ०.२९ ५.९३ PNAN-22 ०.७७ ४.०२ १.२४ ७.४१ ०.६१ ५.०२ ०.२९ ३.४९ ०.४२ ३.९८ PNAN-23 ०.४ १.२५ ०.७५ ६.२५ ०.८८ ५.९१ ०.९ ५.०६ ०.८२ ६.७१ PNAN-24 ०.४५ १.१ ०.६३ २.५ ०.५५ ५.३२ ०.९ ४.३ ०.७१ ३.५ PNAN-25 ०.३६ 1 ०.७३ २.४ ०.६६ ५.१ ०.८२ 4 ०.७ ३.४

तालिका 2: पट्टिका सरणी परख में उंर मिलान नियंत्रण सीरम नमूनों की स्क्रीनिंग लिपिड कम दवाओं के अंतर प्रभाव दिखाते हैं । दवा के बिना नियंत्रण की तुलना में (कॉलम 2, 3), ezetimibe के साथ मशीन सीरम नमूनों (कॉलम 4, 5), lovastatin (कॉलम 6, 7), simvastatin (कॉलम 8, 9), और नियासिन (कॉलम 10, 11) रैखिक के आकार का एलडीएल और एचडीएल कोलेस्ट्रॉल उत्प्रेरण पर रूपांतरों दिखाया कणों का गठन ।

Discussion

सामांय में, VLDL, एलडीएल, और रक्त परिसंचरण में एचडीएल कोलेस्ट्रॉल कणों के वितरण और कार्यात्मक गुण मुख्य रूप से चयापचय, आनुवंशिक, महामारी विज्ञान, सेलुलर, और प्लाज्मा कारकों द्वारा निर्धारित कर रहे हैं22,23. वर्तमान अध्ययन में, बफर में लिपिड संशोधित दवाओं के प्रभाव की जांच से पता चला कि अत्यधिक lipophilic दवाओं जैसे ezetimibe, lovastatin, simvastatin, और atorvastatin कोलेस्ट्रॉल कणों की आकृति विज्ञान पर एक उच्च स्तर की जटिलता प्रेरित उच्च हाइड्रोफिलिक rosuvastatin और fluvastatin दवाओं के साथ मनाया निचले स्तर प्रभाव की तुलना में । इन परिणामों को हमारे पिछले एक गैर एंजाइमी तंत्र का वर्णन के साथ अच्छे समझौते में है statins के आधारित प्रभाव मॉडुलन में एलडीएल और एचडीएल कोलेस्ट्रॉल कणों गठन बफर और सीरम नमूने में21. तदनुसार, वर्तमान अध्ययन से परिणाम ezetimibe, नियासिन, fibrate, और ओमेगा-3 फैटी एसिड दवाओं है कि कोलेस्ट्रॉल कण गठन नियमन में एक प्रत्यक्ष भूमिका निभा सकता है की कार्रवाई के एक गैर एंजाइमी तंत्र का पता चला । यह संभव है कि दवाओं और कोलेस्ट्रॉल समुच्चय के बीच बातचीत के बड़े आकार के विधानसभा कोलेस्ट्रॉल कणों की ओर जाता है कि 2-60µm2, प्रदर्शन गोलाकार और रैखिक कतरा morphologies हैं ।

इसके अलावा, शुद्ध लिपोप्रोटीन कणों का उपयोग कर प्राप्त परिणामों कोलेस्ट्रॉल समुच्चय और VLDL, एलडीएल सहित प्लाज्मा कारकों के बीच बातचीत का सुझाव है, और एचडीएल प्रोटीन कि रचनाओं और कोलेस्ट्रॉल के रूपात्मक गुणों को बदल सकता है कणों. दवा उपचार के परिणाम शुद्ध लिपोप्रोटीन कणों को शामिल एक उच्च स्तर पर दवा प्रभाव VLDL कणों गठन पर उनके प्रभाव की तुलना में संकेत दिया एलडीएल कोलेस्ट्रॉल कणों गठन पर मनाया. lovastatin, simvastatin, और ezetimibe दवाओं समर्थक दवाओं के रूप में इस्तेमाल किया गया और परख में उनकी खुराक शारीरिक सांद्रता से अधिक हो सकता है ।

दिलचस्प है, सीरम नमूनों की स्क्रीनिंग VLDL, एलडीएल, और एचडीएल कोलेस्ट्रॉल कणों के गठन, रैखिक आकार का एलडीएल और एचडीएल कणों के संरचनाओं पर विशेष रूप से उनके प्रभाव के प्रोफाइल बदलने पर दवा प्रभाव के रूपांतरों दिखाया । इन दवाओं में रैखिक आकार का एलडीएल और एचडीएल कोलेस्ट्रॉल कणों गठन दोनों डिसलिपिडेमिया और उम्र में सामान्य सीरम नमूने मिलान में कमी प्रेरित किया । दवा प्रभाव रेखीय आकार के कणों के गठन को कम करने पर मनाया simvastatin, ezetimibe, lovastatin, और नियासिन में उच्च था । गोलाकार और रैखिक किनारा morphologies के साथ कोलेस्ट्रॉल कणों की पहचान सामान्य और डिसलिपिडेमिया सीरम नमूनों में पता चलता है कि समान morphologies के साथ कणों में vivo शर्तों में फार्म कर सकते हैं. पिछले अध्ययनों से मानव और ApoE के atherosclerotic सजीले टुकड़े में डिस्क और सुई की तरह कोलेस्ट्रॉल क्रिस्टल की उपस्थिति की पहचान की है-/ और LDLR-/ चूहों मॉडल24,25,26 ,27,28.

रक्त में घूम एचडीएल कणों एक विषम मिश्रण के रूप में मौजूद है और कार्यात्मक गतिविधि के साथ साथ छोटे और बड़े आकार एचडीएल कणों के स्तर पर रिवर्स कोलेस्ट्रॉल परिवहन के माध्यम से अपने कार्डियो सुरक्षात्मक प्रभाव डालती करने के लिए महत्वपूर्ण कारक हैं मार्ग२९,३०. हाल के अध्ययनों से कोलेस्ट्रॉल समाप्ति, विरोधी सूजन, विरोधी थ्रोम्बोटिक, और विरोधी oxidative के रूप में कई जैविक कार्यों में उनकी भूमिका elucidating के लिए एचडीएल कोलेस्ट्रॉल कण उपभागों की पहचान के महत्व पर प्रकाश डाला है31 . इसके अलावा, अध्ययनों की एक संख्या प्लाज्मा1,5,21में एचडीएल के मध्यम स्तर को बढ़ाने में लिपिड कम चिकित्सा के प्रभाव की सूचना दी है । तदनुसार, इस अध्ययन से परिणाम कोलेस्ट्रॉल कणों की रूपात्मक सुविधाओं पर नए अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं । विशेष रूप से, डिसलिपिडेमिया विषयों के सीरम नमूनों में रैखिक आकार एचडीएल कोलेस्ट्रॉल कणों के एक उच्च स्तर का पता लगाने के लिए कि वे दोनों निदान और रोगियों में लिपिड को संशोधित करने के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए विश्वसनीय मार्कर हो सकता है पता चलता है. हालांकि, आगे की जांच के लिए बड़ी नैदानिक नमूनों का उपयोग करने के लिए बेहतर अलग morphologies और सीवीडी के लिए उनके सहयोग के साथ कोलेस्ट्रॉल कणों को समझने की आवश्यकता है ।

कोलेस्ट्रॉल कणों की विधानसभा पर दवा प्रभाव की जांच के लिए पट्टिका सरणी परख में, हम प्रतिदीप्ति के 2 µ जी इस्तेमाल किया कोलेस्ट्रॉल समुच्चय और 5 µ गोफ प्रत्येक दवा क्योंकि: (1) दवाओं प्रतियोगी दोनों प्रतिदीप्ति लेबल कोलेस्ट्रॉल के लिए बाध्य और अंतर्जात लिपिड सीरम नमूनों में मौजूद; (2) प्रत्येक नमूने से, हम ५,००० करने के लिए १०,००० कोलेस्ट्रॉल कणों कि बड़े आकार और आकार से लेकर ~ 2-60µ2 में इकट्ठे कर रहे हैं हासिल कर लिया; (3) हम सीरम दवाओं के साथ मशीन के नमूनों के बीच दवा की प्रतिक्रिया की एक विस्तृत विविधताओं मनाया (खुराक ३०० 5 µ जी को एनजी) और उनमें से ~ 1-5% उच्च खुराक के साथ मशीन कोलेस्ट्रॉल कणों के गठन के प्रोफ़ाइल में कोई जासूसी परिवर्तन दिखाया; और (4) कोलेस्ट्रॉल समुच्चय और लिपिड कम दवाओं के बीच बातचीत एक गैर एंजाइमी प्रक्रिया द्वारा मध्यस्थता है । इसलिए, परख में इस्तेमाल किया एजेंट की सांद्रता उनके शारीरिक स्तर से अधिक हो सकता है ।

अंत में, हम सफलतापूर्वक एक इन विट्रो इमेजिंग विधि के लाभ का प्रदर्शन किया है लिपिड के एक व्यापक स्पेक्ट्रम के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए इस अध्ययन में वर्णित-आकृति विज्ञान और कोलेस्ट्रॉल की संरचना मॉडुलन पर-कम दवाओं कणों. visualizing और छवि विश्लेषण एल्गोरिदम का एक नक्षत्र को रोजगार के द्वारा लिपिड कणों की आकृति विज्ञान को बढ़ाता के दृष्टिकोण दोनों atherosclerosis के निदान में मदद कर सकते है और रोगियों में लिपिड कम चिकित्सा के परिणामों का मूल्यांकन करने के लिए ।

Disclosures

Dr. Madasamy Plaxgen, Inc से अनुदान सहायता प्राप्त है और एक प्रतिस्पर्धा वित्तीय हित है । अंय लेखकों को कोई होड़ वित्तीय हितों का खुलासा किया है ।

Acknowledgments

यह काम एक Plaxgen अनुसंधान द्वारा वित्त पोषित किया गया था एसएम (PLX-१००८) को संमानित किया अनुदान । आईआरबी की मंजूरी के तहत atherosclerosis विषयों से सीरम के नमूनों को इकट्ठा करने के लिए हम पालो ऑल्टो मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन रिसर्च इंस्टीट्यूट को धन्यवाद देते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TopFluor fluorescent cholesterol Avanti Polar lipids store 100 µl aliquots at -20 °C
simvastatin (pro-drug) Cayman Chemicals store 100 µl aliquots at -20 °C
lovastatin (pro-drug) Cayman Chemicals store 100 µl aliquots at -20 °C
rosuvastatin Cayman Chemicals store 100 µl aliquots at -20 °C
atorvastatin Cayman Chemicals store 100 µl aliquots at -20 °C
fluvastatin Cayman Chemicals store 100 µl aliquots at -20 °C
ezetimibe (pro-drug) Cayman Chemicals store 100 µl aliquots at -20 °C
Niacin MilliporeSigma store 100 µl aliquots at -20 °C
fibrate MilliporeSigma store 100 µl aliquots at -20 °C
omega-3 fatty acid MilliporeSigma store 100 µl aliquots at -20 °C
purified VLDL proteins/particles Lee Bio
purified LDL proteins/particles Lee Bio
purified HDL proteins/particles Lee Bio
Human age-matched serum Dx Biosamples
Human atherosclerosis serum Bioserve
Human normal serum Stanford Blood center
LDL measurement reagent pack Roche Diangostics
HDL measurement reagent pack Roche Diangostics
Total cholesterol measurment Roche Diangostics
96-well microtitre plates
Triglycerides measurement Roche Diangostics
Amnis Imaging Flow cytometer Amnis Inc
IDEAS image analysing software Amnis Inc
Chemistry Analyzer-1, ChemWel 2902 Awarness Technology
Chemistry Analyzer-2, Intergra 400 Roche Diangostics

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References

  1. Pahan, K. Lipid-lowering drugs. Cell Mol Life Sci. 63, 1165-1178 (2006).
  2. Laforest, L., et al. Prevalence of low high-density lipoprotein cholesterol and hypertriglyceridaemia in patients treated with hypolipidaemic drugs. Arch Cardiovasc Dis. 102, 43-50 (2009).
  3. Roberts, W. C. Preventing and arresting coronary atherosclerosis. Am Heart J. 130, 580-600 (1995).
  4. Goldstein, J. L., Brown, M. S. A century of cholesterol and coronaries: from plaques to genes to statins. Cell. 16, 161-172 (2015).
  5. Drexel, H. Statins, fibrates, nicotinic acid, cholesterol absorption inhibitors, anion-exchange resins, omega-3 fatty acids: which drugs for which patients? Fundam Clin Pharmacol. 23, 687-692 (2009).
  6. Camelia, S., Anca, S. Statins: Mechanism of action and effects. J.Cell.Mol.Med. 5, 378-387 (2001).
  7. Schaefer, E. J., et al. Comparisons of effects of statins (atorvastatin, fluvastatin, lovastatin, pravastatin, and simvastatin) on fasting and postprandial lipoproteins in patients with coronary heart disease versus control subjects. Am J Cardiol. 93, 31-39 (2004).
  8. Meyers, C. D., Kamanna, V. S., Kashyap, M. L. Niacin therapy in atherosclerosis. Curr Opin in Lipid. 15, 659-665 (2004).
  9. Phan, B. A., Dayspringm, T. D., Toth, P. P. Ezetimibe therapy: mechanism of action and clinical update. Vasc Health Risk Mana. 8, 415-427 (2012).
  10. Leitersdorf, E., Fruchart, J. C. Mechanism of action of fibrates on lipid and lipoprotein metabolism. Circulation. 98, 2088-2093 (1998).
  11. Backes, J., Anzalone, D., Hilleman, D., Catini, J. The clinical relevance of omega-3 fatty acids in the management of hypertriglyceridemia. Lipids Health Dis. 15, 118 (2016).
  12. Davidson, M. H. Clinical Significance of Statin Pleiotropic Effects Hypotheses Versus Evidence. Circulation. 111, 2280-2281 (2005).
  13. Chinetti-Gbaguidi, G., Fruchart, J. C., Staels, B. Pleiotropic effects of fibrates. Curr Atheroscler Rep. 7, 396-401 (2005).
  14. McTaggart, F., Jones, P. Effects of Statins on High-Density Lipoproteins: A Potential Contribution to Cardiovascular Benefit Effects of Statins on High-Density Lipoproteins: A Potential Contribution to Cardiovascular Benefit. CardiovascDrugs Ther. 22, 321-338 (2008).
  15. Quehenberger, O., et al. The Human Plasma Lipidome. N Engl J Med. 365, 1812-1823 (2011).
  16. Lund-Katz, S., et al. Mechanisms responsible for the compositional heterogeneity of nascent high density lipoprotein. J. Biol Chem. 288, 23150-23160 (2013).
  17. Krauss, R. M. Lipoprotein subfractions and cardiovascular disease risk. Curr Opin Lipidol. 21, 305-311 (2010).
  18. Krauss, R. M., Burke, D. J. Identification of multiple subclasses of plasma low density lipoproteins in normal humans. J Lipid Res. 23, 97-104 (1982).
  19. Rosenson, R. S., et al. HDL measures, particle heterogeneity, proposed nomenclature, and relation to atherosclerotic cardiovascular Events. Clinic Chemi. 57, 392-410 (2011).
  20. Madasamy, S., et al. Plaque array method and proteomics-based identification of biomarkers from Alzheimer's disease serum. Clin Chim Acta. 441, 79-85 (2015).
  21. Madasamy, S., et al. Nonenzymatic Mechanism of Statins in Modulating Cholesterol Particles Formation. Am J Cardiol. 118, 1187-1191 (2016).
  22. Peter, O. K. Clinical relevance of the biochemical, metabolic, and genetic factors that influence low-density lipoprotein heterogeneity. Am J Cardiol. 90, 30-47 (2002).
  23. Weissglas-Volkov, D., Pajukanta, P. Genetic causes of high and low serum HDL-cholesterol. J Lipid Res. 51, 2032-2057 (2010).
  24. Abela, G. S. Effect of statins on cholesterol crystallization and atherosclerotic plaque stabilization. Am J Cardiol. 107, 1710-1717 (2011).
  25. Nidorf, S. M., Eikelboom, J. W., Thompson, P. L. Targeting cholesterol crystal-induced inflammation for the secondary prevention of cardiovascular disease. Cardiovasc Pharmacol Ther. 19, 45-52 (2014).
  26. Thacker, S. G., Zarzour, A., Chen,, et al. High density lipoprotein reduces inflammation from cholesterol crystals by inhibiting inflammasome activation. Immunol. 149, 306-319 (2016).
  27. Kim, S. H., Lee, E. S., Lee, J. Y., et al. Multiplex coherent anti-stokes Raman Spectroscopy images intact atheromatous lesions and concomitantly identifies distinct chemical profiles of atherosclerotic lipids. Circ Res. 106, 1332-1341 (2010).
  28. Lim, R. S., Suhalim, J. L., Miyazaki-Anzai, S., et al. Identification of cholesterol crystals in plaques of atherosclerotic mice using hyperspectral CARS imaging. J Lipid Res. 52, 2177-2186 (2011).
  29. Rothblat, G. H., Phillips, M. C. High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport. Curr Opin Lipidol. 21, 229-238 (2011).
  30. Kontush, A. HDL particle number and size as predictors of cardiovascular disease. Front in Pharmacol. , (2015).
  31. Karathanasis, S. K., Freeman, L. A., Gordon, S. M., Remaley, A. T. The changing face of HDL and the best way to measure it. Clin. Chem. 63, 196-210 (2017).

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