O objetivo deste estudo foi avaliar em vitro hipolipemiantes efeitos de drogas em modulando a morfologia das partículas de colesterol. Comparação de drogas hipolipemiantes revelou variações no seu efeito em modulando as características morfológicas das partículas de colesterol.
Tratamento de pacientes com dislipidemia com fármacos hipolipemiantes leva a uma redução significativa no nível de lipoproteínas de baixa densidade (LDL) e um baixo a moderado nível de aumento do colesterol da lipoproteína de alta densidade (HDL) no plasma. No entanto, um possível papel destas drogas em alterar a morfologia e distribuição das partículas de colesterol é mal compreendido. Aqui, descrevemos em vitro avaliação dos efeitos de drogas hipolipemiantes na modulação das características morfológicas das partículas de colesterol, usando o método de matriz de placa em combinação com imaging citometria de fluxo. Análises de imagem das partículas de colesterol indicaram que a lovastatina, sinvastatina, ezetimiba e atorvastatina induzem a formação de partículas em forma de vertente globulares e lineares, Considerando que a niacina, fibratos, fluvastatina e Rosuvastatina induzem o formação de apenas globular em forma de partículas. Em seguida, muito purificada lipoproteína de baixa densidade (VLDL) e partículas de LDL incubadas com estas drogas mostraram alterações na morfologia e imagem textura de colesterol subpopulações de partículas. Além disso, o rastreio de 50 amostras de soro revelou a presença de um maior nível de linear em forma de partículas de HDL colesterol em indivíduos com dislipidemia (média de 18,3%) em comparação com as amostras de idade de correspondência normal (média de 11,1%). Observou-se também variações consideráveis em efeitos de drogas hipolipemiantes na redução linear em forma de formação partículas de LDL e HDL colesterol em amostras de soro. Esses achados indicam que drogas hipolipemiantes, além de seus efeitos hipolipidémico mediada por células, diretamente podem modular a morfologia das partículas de colesterol por um mecanismo não-enzimática de ação. Os resultados destes resultados têm potencial para informar o diagnóstico de aterosclerose e prever a terapia ideal hipolipemiantes.
Numerosos estudos clínicos têm demonstrado os efeitos benéficos das drogas hipolipemiantes em reduzir os níveis plasmáticos de colesterol de lipoproteínas de baixa densidade (LDL) e um baixo a moderado nível de aumento do colesterol da lipoproteína de alta densidade (HDL), que impede a incidência de primária e secundária de eventos cardiovasculares adversos relacionados à aterosclerose1,2,3,4,5. Estatinas, um grupo de inibidores da HMG-CoA redutase enzima, bloqueiam a síntese endógena de colesterol no fígado que, em vez de chumbo para abaixar circulando os níveis de colesterol LDL no sangue6,7. Da mesma forma, os lipídios diminuindo o efeito de niacina é mediado pela sua inibição direta e não-competitivas de hepatócito diacilglicerol aciltransferase-2, uma enzima hepática chave envolvidos na síntese de triglicérides8. Comparativamente, a ezetimiba reduz o nível plasmático de LDL, limitando a absorção do colesterol exógeno por ligação a proteína 1 de C1-Like de Niemann-Pick (NPC1L1) localizada nas células epiteliais do intestino delgado9. Fenofibrato, outro drogas hipolipemiantes, reduz substancialmente as concentrações plasmáticas de triglicérides e também moderadamente diminui o colesterol LDL através o Peroxissoma proliferator-activated receptores via10. Além disso, o ácido graxo ômega-3 é relatado para ter o efeito antiaterosclerótico devido à sua capacidade para reduzir os níveis plasmáticos de LDL11.
As drogas hipolipemiantes, além de seu efeito primário na redução de colesterol LDL, têm um número de efeitos pleiotrópicos benéficos, incluindo realçando o nível de HDL, melhorando funções endoteliais, reduzir a inflamação e inibição plaquetária agregações12,13,14. No entanto, o mecanismo subjacente destas drogas no aumento de partículas de colesterol HDL e modificando suas características estruturais não são totalmente compreendidos. Uma vez que estes medicamentos são amplamente prescritos para tratar doenças cardiovasculares relacionadas com a aterosclerose (doenças cardiovasculares), é essencial para investigar suas possíveis funções na determinação das características morfológicas e distribuição das partículas de lipídios. O plasma humano lipidome consiste de aproximadamente 600 distintos lípidos e 22 tipos diferentes de moleculares de colesterol que estão presentes em vários tamanhos, formas, densidades e composições15,16,17 . Métodos analíticos tais como ultracentrifugação, NMR e eletroforese em gel de gradiente são usados para caracterizar partículas LDL e HDL e seus subfractions18,19. No entanto, a aplicação destes métodos é limitada a estudos que visam determinar o efeito de drogas em morfologia e montagem das partículas de lipídios de modulação. A matriz de placa com base de citômetro de fluxo é um ensaio de bioquímico funcional desenvolvido para a deteção e a visualização de soro derivado lipídico e amiloide placa partículas20. As vantagens do em vitro método descrito neste estudo de imagem possibilitam a identificação de lipídios-modulando efeitos de drogas em alterar a morfologia e distribuição das partículas de colesterol em amostras de buffer e soro.
Em geral, a distribuição e propriedades funcionais das partículas de colesterol HDL, LDL e VLDL na circulação sanguínea são determinadas principalmente pela metabólico, genético, epidemiológico, celular e plasma fatores22,23. No presente estudo, analisar os efeitos da modificação de lipídios drogas no buffer revelaram que drogas altamente lipofílicas como a ezetimiba, sinvastatina, lovastatina e atorvastatina induziram uma complexidade de nível superior na morfologia das partículas de colesterol em comparação com o efeito de nível mais baixo observado com drogas altamente hidrofílicas de Rosuvastatina e fluvastatina. Estes resultados estão em boa concordância com nosso estudo anterior, descrevendo um efeito não enzimáticos mecanismo baseado das estatinas em LDL e HDL formação de partículas de colesterol no buffer e soro amostras21de modulação. Por conseguinte, os resultados do presente estudo revelaram um mecanismo não-enzimática de ação da ezetimiba, fibrato, niacina e ácido graxo ômega-3 drogas que podem desempenhar um papel directo na formação de partículas de colesterol de modulação. É possível que as interações entre drogas e agregados de colesterol leva à assembleia de partículas de colesterol de grandes dimensões que são 2-60 µm2, exibindo morfologias vertente globulares e linear.
Além disso, os resultados obtidos usando partículas de lipoproteína purificada sugerem interações entre agregados de colesterol e fatores de plasma, incluindo proteínas HDL, LDL e VLDL que podem alterar as composições e propriedades morfológicas do colesterol partículas. Os resultados do tratamento de drogas envolvendo partículas de lipoproteína purificada indicam um efeito de drogas de nível superior na formação de partículas de VLDL em relação ao seu efeito observado na formação de partículas de colesterol LDL. As ezetimiba, sinvastatina e lovastatina drogas foram usadas como pro-drogas e suas doses em ensaios podem ser maiores do que as concentrações fisiológicas.
Curiosamente, triagem de amostras de soro mostrou variações do efeito de drogas em alterar os perfis de formação de partículas de colesterol HDL, LDL e VLDL, especialmente seus efeitos sobre as formações da linear em forma de partículas de LDL e HDL. Estas drogas induziram redução linear em forma de LDL e HDL formação de partículas de colesterol em dislipidemia e amostras de soro normal de idade correspondente. Os efeitos de droga observados na redução da formação de partículas de forma linear foi maior no ezetimiba, sinvastatina, lovastatina e niacina. A identificação das partículas de colesterol com morfologias vertente globulares e linear nas amostras de soro normal e dislipidemia sugere que as partículas com morfologias semelhantes podem formar em condições na vivo . Estudos anteriores identificaram a presença de disco e cristais de colesterol de agulha-como na ateroma de humanos e ApoE– / – e LDLR– / – ratos modelos24,25,26 ,de27,28.
As partículas de HDL circulantes no sangue existem como uma mistura heterogênea e o nível das partículas de HDL de pequeno e grande porte juntamente com atividade funcional são fatores importantes para exercer seu efeito cardio-protetor através do transporte reverso de colesterol percurso de29,30. Estudos recentes salientaram a importância de identificar subfractions de partículas HDL colesterol para elucidar seu papel em várias funções biológicas como o efluxo de colesterol, anti-inflamatório, anti-trombótica e antioxidativo31 . Além disso, vários estudos têm relatado o efeito da terapia de hipolipemiantes em aumentar um ponto baixo para moderar o nível de HDL no plasma1,5,21. Nesse sentido, os resultados deste estudo fornecem introspecções novas em características morfológicas das partículas de colesterol. Notavelmente, a detecção de um maior nível de linear em forma de partículas de HDL colesterol nas amostras de soro de dislipidemia assuntos sugere que eles podem ser o biomarcador confiável para diagnóstico e avaliar os efeitos da modificação de lipídios drogas em pacientes. No entanto, mais investigação é necessária usando grandes amostras clínicas para entender melhor as partículas de colesterol com morfologias distintas e sua associação à DCV.
No ensaio de matriz da chapa para examinar o efeito de drogas no conjunto de partículas de colesterol, usamos 2 µ g de fluorescência rotulado agregados de colesterol e 5 µgof cada droga porque: (1) drogas competitivamente ligar para ambos fluorescência rotulado de colesterol e endógenos lípidos presentes nas amostras de soro; (2) de cada amostra, adquirimos as partículas de colesterol de 5.000 a 10.000 que são montadas em grandes tamanhos e formas, que variam de ~ 2-60 µ2; (3) observamos um variações de resposta de drogas entre as amostras de soro, incubadas com as drogas (doses 300 ng de 5 µ g) e ~ 15% deles incubadas com altas doses não mostrou nenhuma alteração detectável no perfil de formação de partículas de colesterol; e (4) a interação entre agregados de colesterol e drogas hipolipemiantes é mediada por um processo não enzimáticos. Portanto, as concentrações dos reagentes usados no ensaio podem ser superiores a seu nível fisiológico.
Em conclusão, temos com sucesso demonstrado as vantagens de um em vitro método descrito neste estudo para determinar o efeito de um amplo espectro de drogas hipolipemiantes na morfologia e composição de colesterol de modulação de imagem partículas. A abordagem de Visualizar e quantificar a morfologia das partículas de lipídios, empregando uma constelação de algoritmos de análise de imagem pode ajudar o diagnóstico de aterosclerose e avaliar os resultados da terapia de hipolipemiantes em pacientes.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado por uma pesquisa Plaxgen subsídio concedido a SM (PLX-1008). Agradecemos a Palo Alto Medical Research Foundation Research Institute para a coleta de amostras de soro de indivíduos aterosclerose sob aprovação do IRB.
TopFluor fluorescent cholesterol | Avanti Polar lipids | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
simvastatin (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
lovastatin (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
rosuvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
atorvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
fluvastatin | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
ezetimibe (pro-drug) | Cayman Chemicals | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
Niacin | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
fibrate | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
omega-3 fatty acid | MilliporeSigma | store 100 µl aliquots at -20 °C | |
purified VLDL proteins/particles | Lee Bio | ||
purified LDL proteins/particles | Lee Bio | ||
purified HDL proteins/particles | Lee Bio | ||
Human age-matched serum | Dx Biosamples | ||
Human atherosclerosis serum | Bioserve | ||
Human normal serum | Stanford Blood center | ||
LDL measurement reagent pack | Roche Diangostics | ||
HDL measurement reagent pack | Roche Diangostics | ||
Total cholesterol measurment | Roche Diangostics | ||
96-well microtitre plates | |||
Triglycerides measrument | Roche Diangostics | ||
Amnis Imaging Flow cytometer | Amnis Inc | ||
IDEAS image analysing software | Amnis Inc | ||
Chemistry Analyzer-1, ChemWel 2902 | Awarness Technology | ||
Chemistry Analyzer-2, Intergra 400 | Roche Diangostics |