Метод для маркировки стенограммы в клетках отдельных кишечная палочка для одной молекулы флуоресценции в Situ гибридизация экспериментов
Summary
Эта рукопись описывает метод для маркировки отдельных матричная РНК (мРНК) стенограммы датчиками дневно меченых ДНК, для использования в одной молекулы флуоресценции в situ гибридизация (smFISH) эксперименты в E. coli. smFISH — метод визуализации, который позволяет одновременного обнаружения, локализации и количественной оценки одной молекулы мРНК в фиксированных отдельных ячеек.
Abstract
Описан метод для маркировки отдельных матричная РНК (мРНК) стенограммы в фиксированных бактерий для использования в одной молекулы флуоресценции в situ гибридизация (smFISH) эксперименты в E. coli. smFISH позволяет измерение к ячейке изменчивости в мРНК копировать количество генов интерес, а также субцеллюлярные расположение стенограммы. Основные шаги, фиксация культуры бактериальных клеток, permeabilization клеточных мембран и гибридизации целевой стенограммы с наборами коммерчески доступных короткие дневно меченых олигонуклеотидных зондов. smFISH может позволить изображения стенограммы нескольких генов в той же ячейке, с ограничения, налагаемые спектральных дублирования между различными флуоресцентных маркеров. После завершения протокола, показанная ниже клетки может быть легко образы с помощью микроскопа, в сочетании с камерой для низк интенсивности флуоресценции. Эти изображения, а также контуры клеток, полученные от сегментации фазы контраст кадров, или от пятнать клеточных мембран, позволяют рассчитать мРНК копии номер распределения образец клеток с открытым исходным кодом или заказ программного обеспечения. Обозначая метод, описанный здесь может также применяться для изображения стенограммы с стохастических оптических реконструкции микроскопии (шторм).
Introduction
Stochasticity является фундаментальных и неизбежным аспектом экспрессии генов и приводит к ячейке неоднородность1, как на уровне стенограммы и белки2,3. Количественная оценка изменчивости между ячейками при четко определенных условиях открывает уникальный в основные процессы, которые лежат в основе экспрессии генов и его регулирования. Одним из важных источников неоднородности ячеек в бактерий происходит на уровне транскрипционный анализ. Стенограмма цифры варьируются не только благодаря stochasticity транскрипции, но и post-transcriptional процессы, такие как регулирование малых молекул РНК и RNAases2. Одним из способов прямого доступа к этой неоднородности в количественных моды является дневно пометки отдельных стенограммы данного гена в smFISH. Эта методология позволяет обнаружение и локализация внутриклеточных конкретных молекул РНК в фиксированной,4отдельных бактериальной клетки. мРНК гибридизированных с набором дневно меченых ~ 20 база Лонг олигонуклеотиды, которые предназначены для привязки выборочно стенограммы интерес5,6. Несколько маркировки обеспечивает обнаружение выше фона флуоресценции, и отдельные молекулы мРНК появляются как дифракционный пятна под флуоресцентным микроскопом7 (см. Рисунок 1). Существуют другие подходы для маркировки молекулы мРНК, в которых дополнительные олигомера зонды нести конъюгированных гаптенами (например, биотин или digoxigenin), которые обнаруживаются с помощью вторичных дневно меченых репортер методы8.
Существуют другие методы, которые обеспечивают количественной информации о стенограммы, в дополнение к smFISH. Некоторые, такие как Северная пятно или количественного PCR, зонд основная и таким образом можно измерить количество мРНК копий ни их позиции в отдельных клетках. Поэтому эти методы не подходят для количественного определения изменчивости к ячейке. Недавно на основе изображения метод, который позволяет для количественной оценки как копирование количество РНК в клетки, так и их внутриклеточного расположения, называется мультиплексированием ошибка надежные флуоресценции в situ гибридизация (MERFISH) был разработан. MERFISH основан на уступки уникальный штрих-код, состоящий из определенной комбинации из фиксированного числа дневно меченых олигонуклеотидных зондов. Эти штрих-коды зачитываются в последовательных раундов smFISH измерений, с Фотообесцвечивание ниже каждого раунда гибридизации, тем самым увеличивая пропускную способность на два порядка9,10. Эта техника требует автоматизированных жидкости, обработка системы и надлежащего дизайн набора зонд.
Сочетание нескольких флуоресценции маркировки отдельных стенограмм, а также Роман суперразрешением методы, такие как стохастические оптических реконструкции микроскопии (шторм)11, позволяет десятикратное увеличение в резолюции Локализация внутриклеточных стенограмм. В шторм подходящее сочетание флуоресцентных зондов и визуализации буфера позволяет несколько циклов флуоресценции выбросов на молекулу зонд (мигает). ШТОРМ может также использоваться для изображения транскриптом E. coli и наблюдать пространственной организации генома общесистемной РНК, путем маркировки одновременно все стенограммы интерес12.
Все методы одноклеточных, рассмотренных выше основаны на визуализации стенограммы в стационарных клетках. Следовательно они не обеспечивают никакой информации относительно кинетических свойств стенограммы внутри клетки. Чтобы следовать стенограммы в живые клетки13, мРНК могут быть помечены сплавливанием гена интереса к массиву привязки сайтов. Эти последние затем распознаются RNA-связывая протеин, например бактериофага MS2 пальто белка, который сливается с флуоресцентных белков, таких как Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП)10,14,15.
Здесь мы описываем метод для маркировки индивидуальных mRNAs с набором зондов дневно меченых ДНК, для использования в smFISH эксперименты, в частности в E. coli. Кроме того мы показываем, что та же схема маркировки могут быть использованы для измерения ШТОРМА с незначительными изменениями.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы измерили в нашей лаборатории Стенограмма количество различных генов в клетках E. coli , с помощью метода smFISH2. Короче говоря, эта процедура состоит из следующих этапов: клетки фиксации, permeabilization мембран для проникновения щупа, зонд гибридизации и образцы изображений, и?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Израиль научного фонда Грант 514415 (и.с.) и BSF-NSF (MCB) Грант 2016707 (и.с.). Поддержка Зигфрид и Ирма Ульман, также признается профессорской кафедры (чтобы и.с.).
Materials
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Pure Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute | Mallinckrodt Baker – Avantor | 8025.25 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free 20X SSC | Life Technologies/Ambion | AM9763 | |
| RNase-free 10X PBS | Life Technologies/Ambion | AM9625 | |
| TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, for molecular biology | Sigma-Aldrich | 93283 | |
| nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Formaldehyde solution for molecular biology, 36.5-38% in water | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Deionized formamide, nuclease free | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9342 | |
| E. coli tRNA (ribonucleic acid, transfer type xx from escherichia) | Sigma-Aldrich | R1753-500UN | |
| UltraPure BSA (50mg/ml) | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM2616 | |
| Vanadyl-ribonucleoside complex,VRC, 200 mM | New England Biolab | S1402S | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Cysteamine and oxygen | Sigma-Aldrich | 30070 | |
| Glucose Oxidase from Aspergillus niger, Type VII, 50KU | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-fucose | Sigma-Aldrich | F8150 | |
| Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | Life Technologies | V2286 | |
| Agarose,low melting reagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Adhesive silicone isolator 24-2mm Dia. X 1.8 mm depth JTR24R-A2-2.0 | Grace Bio-Labs | JTR24R-A2-2.0 666208 | |
| poly-D-lysine-coated glass bottom Glass Bottom Culture Dishes | MatTek Corporation | P35GC-1.5-14-C | |
| Super life nitrile powder free examination gloves | Supermax | TC-N-9889 | |
| Brand sterilization incubator tape | Sigma-Aldrich | BR61750 | |
| Microcentrifuge tubes (1.8 ml) | Axygen – Corning Life Sciences | MCT-175C | |
| Falcon round-bottom polypropylene tubes (14 ml) | BD Biosciences | 352059 | |
| Conical-bottom centrifuge polypropylene tubes (50 ml) | Corning | 430828 | |
| Serological pipettes (Corning 5 ml) | Corning Life Sciences | 4051 | |
| Serological pipettes (Corning 10 ml) | Corning Life Sciences | 4488 | |
| Serological pipettes (Corning 25 ml) | Corning Life Sciences | 4251 | |
| Spectrophotometer cuvettes | Sarstedt | 67.742 | |
| RNase-free pipette tips 0.2 – 20 μl | FroggaBio | FT20 | |
| RNase-free pipette tips 10 – 200 μl | Axigene/corning | TF-200 | |
| RNase-free pipette tips 100 – 1000 μl | FroggaBio | FT1000 | |
| RNase-free pipette tips 100 – 1000 μl | Sorenson | 14200 | |
| Syringe disposile 10 mL needle G-21 | Becton Dickinson, Biosciences | BD-309643 | |
| Minisart 0.2 um Syringe Filter | Sartorius | 16534 K | |
| Nikon instruments microscope type A immersion oil A, 8cc | Nikon | MXA20233 | |
| Microscope slides 76 x26, 3"x1"x1mm | Thermo Fisher Scientific | 421-004ET | |
| #0 coverslip slide 24×60 | Thermo Fisher Scientific/Menzel | BNBB024060A0 | |
| Orbital shaker | M.R.C | TOU-50 | |
| Hot block | M.R.C | ||
| Vortex | Fried Electric Company | G-560-E | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Portable Pipet-Aid XP2, Pipette Controller | Drummond Scientific Company | 4-000-501-I | |
| OD600 Spectrophotometer for Bacterial Growth Rates DiluPhotometer | Midsci | OD600-10 | |
| iXon X3 EMCCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | |
| Eclipse Ti microscope | Nikon | MEA53100 | |
| CFI plan apochromat DM 100X oil objective lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13 | Nikon | MRD31905 | |
| Filter set (TRITC/CY3): EX – ET545/30X; EM – ET620/60M; BS – T570LP | Nikon | 49005 | |
| Filter set (CY5): EX – ET640/30X; EM – ET690/50M; BS – T660P | Nikon | 49009 | |
| Nis-elements AR auto reaserch software | Nikon | MQS31000 | |
| STORM microscope | Vutara | SR-200 | |
| NA 1.2 water immersion objective | Olympus | ||
| SRX image acquisition and analysis software | Vutara | ||
| Evolve 512 EMCCD camera | Photometrics | ||
| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with CAL Fluor® Red 590 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for galK mRNA: | |||
| gtgttttttctttcagactc | |||
| tagccaaatgcgttggcaaa | |||
| ctgaatggtgtgagtggcag | |||
| caccaatcaaattcacgcgg | |||
| acgaaaccgtcgttgtagtc | |||
| tgataatcaatcgcgcaggg | |||
| gtggtgcacaactgatcacg | |||
| acgcgaactttacggtcatc | |||
| gctgattttcataatcggct | |||
| gcatcgagggaaaactcgtc | |||
| gttttcatgtgcgacaatgg | |||
| cacgccacgaacgtagttag | |||
| ttacgcagttgcagatgttt | |||
| tccagtgaagcggaagaact | |||
| tgctgcaatacggttccgac | |||
| gtccagcggcagatgataaa | |||
| tgaccgttaagcgcgatttg | |||
| agcctacaaactggttttct | |||
| gcggaaattagctgatccat | |||
| aaggcatgatctttcttgcc | |||
| cagtgagcggcaatcgatca | |||
| tgggcatggaaactgctttg | |||
| gatgatgacgacagccacac | |||
| gggtacgtttgaagttactg | |||
| gtgttgtattcgctgccaac | |||
| ggtttcgcactgttcacgac | |||
| tggctgctggaagaaacgcg | |||
| ttcaatggtgacatcacgca | |||
| catgcgcaacagcgttgaac | |||
| ggcgttttcagtcagtatat | |||
| atacgtttcaggtcgccttg | |||
| tgagactccgccatcaactc | |||
| gaaatcatcgcgcatagagg | |||
| caatttgcggcacggtgatt | |||
| ttgacgatttctaccagagt | |||
| acctttgtcgccaatcacag | |||
| ggatcagcgcgacgatacag | |||
| atattgttcagcgacagctt | |||
| gtctctttaatacctgtttt | |||
| ctccttgtgatggtttacaa | |||
| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with Quaser Fluor® Red 670 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for sodB mRNA: | |||
| gtgttttttctttcagactc | |||
| tagccaaatgcgttggcaaa | |||
| ctgaatggtgtgagtggcag | |||
| caccaatcaaattcacgcgg | |||
| acgaaaccgtcgttgtagtc | |||
| tgataatcaatcgcgcaggg | |||
| gtggtgcacaactgatcacg | |||
| acgcgaactttacggtcatc | |||
| gctgattttcataatcggct | |||
| gcatcgagggaaaactcgtc | |||
| gttttcatgtgcgacaatgg | |||
| cacgccacgaacgtagttag | |||
| ttacgcagttgcagatgttt | |||
| tccagtgaagcggaagaact | |||
| tgctgcaatacggttccgac | |||
| gtccagcggcagatgataaa | |||
| tgaccgttaagcgcgatttg | |||
| agcctacaaactggttttct | |||
| gcggaaattagctgatccat | |||
| aaggcatgatctttcttgcc | |||
| cagtgagcggcaatcgatca | |||
| tgggcatggaaactgctttg | |||
| gatgatgacgacagccacac | |||
| gggtacgtttgaagttactg | |||
| gtgttgtattcgctgccaac | |||
| ggtttcgcactgttcacgac | |||
| tggctgctggaagaaacgcg | |||
| ttcaatggtgacatcacgca | |||
| catgcgcaacagcgttgaac | |||
| ggcgttttcagtcagtatat | |||
| atacgtttcaggtcgccttg | |||
| tgagactccgccatcaactc | |||
| gaaatcatcgcgcatagagg | |||
| caatttgcggcacggtgatt | |||
| ttgacgatttctaccagagt | |||
| acctttgtcgccaatcacag | |||
| ggatcagcgcgacgatacag | |||
| atattgttcagcgacagctt | |||
| gtctctttaatacctgtttt | |||
| ctccttgtgatggtttacaa |
References
- Tsimring, L. S. Noise in biology. Reports Prog. Phys. 77 (2), 26601 (2014).
- Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
- Arbel-Goren, R., et al. Effects of post-transcriptional regulation on phenotypic noise in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 41 (9), 4825-4834 (2013).
- van Gijtenbeek, L. A., Robinson, A., van Oijen, A. M., Poolman, B., Kok, J. On the Spatial Organization of mRNA, Plasmids, and Ribosomes in a Bacterial Host Overexpressing Membrane Proteins. PLOS Genet. 12 (12), e1006523 (2016).
- Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472 (10), (2010).
- Skinner, S. O., La Sepúlveda, ., Xu, H., Golding, I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nat. Protoc. 8 (6), 1100-1113 (2013).
- Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined DNA-RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) to study X chromosome inactivation in differentiated female mouse embryonic stem cells. J. Vis. Exp. (88), e51628 (2014).
- Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 348 (6233), aaa6090 (2015).
- van Gijtenbeek, L. A., Kok, J. Illuminating messengers: An update and outlook on RNA visualization in bacteria. Front. Microbiol. 8, 1-19 (2017).
- Fei, J., et al. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
- Moffitt, J. R., Pandey, S., Boettiger, A. N., Wang, S., Zhuang, X. Spatial organization shapes the turnover of a bacterial transcriptome. Elife. 5, 1-22 (2016).
- Ong, W. Q., Citron, Y. R., Sekine, S., Huang, B. Live Cell Imaging of Endogenous mRNA Using RNA-Based Fluorescence “Turn-On” Probe. ACS Chem. Biol. , (2016).
- Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S. M., Cox, E. C. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123 (6), 1025-1036 (2005).
- Golding, I., Cox, E. C. Chapter 8 Spatiotemporal Dynamics in Bacterial Cells: Real-Time Studies with Single-Event Resolution. Methods Cell Biol. 89 (8), (2008).
- So, L. H., Ghosh, A., Zong, C., Sepulveda, L. A., Segev, R., Golding, I. General properties of transcriptional time series in Escherichia coli. Nat. Genet. 43 (6), 554-560 (2011).
- Spahn, C., Endesfelder, U., Heilemann, M. Super-resolution imaging of Escherichia coli nucleoids reveals highly structured and asymmetric segregation during fast growth. J. Struct. Biol. 185 (3), 243-249 (2014).
- Sliusarenko, O. Microbetracker software. Mol Microbiol. 80 (3), 612-627 (2012).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, 8 (2006).
- Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
- Brandt, U. A two-state stabilization-change mechanism for proton-pumping complex I. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1807 (10), 1364-1369 (2011).
