Méthode pour l’étiquetage des transcriptions dans les cellules individuelles Escherichia coli pour Single-molecule Fluorescence In Situ des expériences d’hybridation
Summary
Ce manuscrit décrit une méthode pour l’étiquetage individuel ARN messager (ARNm) transcriptions avec sondes d’ADN marquées fluorescent, pour une utilisation en single-molecule fluorescence in situ (smFISH) expériences d’hybridation chez e. coli. smFISH est une méthode de visualisation qui permet la détection simultanée, de localisation et quantification des molécules d’ARNm uniques dans des cellules individuelles fixes.
Abstract
On décrit une méthode pour l’étiquetage individuel ARN messager (ARNm) transcriptions chez les bactéries fixes pour utilisation en single-molecule fluorescence in situ (smFISH) expériences d’hybridation chez e. coli. smFISH permet la mesure de la variabilité de la cellule-cellule au nombre de copies d’ADN messagère des gènes d’intérêt, ainsi que la localisation subcellulaire des transcriptions. Les principales étapes sont la fixation de la culture de la cellule bactérienne, la perméabilisation des membranes cellulaires et l’hybridation des transcriptions cible avec jeux de sondes oligonucléotidiques fluorescent marqué disponible dans le commerce du court. smFISH peut permettre à l’imagerie de la transcription de gènes multiples dans la même cellule, avec les limitations imposées par le chevauchement spectral de différents marqueurs fluorescents. Après avoir terminé le protocole illustré ci-dessous, les cellules peuvent être facilement photographiées à l’aide d’un microscope couplé avec un appareil photo destiné à faible intensité fluorescence. Ces images, ainsi que de la cellule des contours obtenus de segmentation d’images de contraste de phase, ou de coloration de membrane cellulaire, permettent le calcul de la distribution de nombre de copie ARNm d’un échantillon de cellules à l’aide de logiciels libres ou écriture personnalisée. La méthode étiquetage décrite ici peut également être appliquée aux transcriptions d’image avec la microscopie stochastique reconstruction optique (tempête).
Introduction
Stochasticité est un aspect fondamental et incontournable de l’expression génique et donne naissance à des cellules hétérogénéité1, tant au niveau de transcription et protéines2,3. Quantification de la variabilité entre les cellules dans des conditions bien définies offre un guichet unique dans les processus de base qui sous-tendent l’expression des gènes et son règlement. Une importante source d’hétérogénéité des cellules chez les bactéries se déroule au niveau transcriptionnel. Nombres de transcription varient non seulement en raison de la stochasticité de transcription, mais aussi à des processus tels que la régulation post-transcriptionnelle par petit RNAs et RNAases2. Une façon d’accéder directement à cette hétérogénéité de façon quantitative est de marquage fluorescent des relevés de notes individuels d’un gène donné en smFISH. Cette méthode permet la détection et la localisation subcellulaire de molécules d’ARN particulières en fixe, les cellules bactériennes individuelles4. ARNm est hybridées avec un ensemble d’oligonucléotides de base-long de ~ 20 fluorescent-étiquetés qui visent à lier sélectivement aux transcriptions d’intérêt5,6. Plusieurs étiquetage garantit une détection au-dessus de fluorescence de fond et des molécules d’ARNm individuelles apparaissent comme des taches de diffraction-limited sous un microscope de fluorescence7 (voir Figure 1). Il existe d’autres approches pour l’étiquetage des molécules d’ARNm, dans laquelle les sondes oligomère complémentaire portent des haptènes conjugués (p. ex., biotine ou digoxigénine) qui sont détectés à l’aide de techniques secondaires journaliste fluorescent marqué8.
Il existe d’autres méthodes qui fournissent des informations quantitatives sur les relevés de notes, en plus de smFISH. Certains, comme le Northern blot ou PCR quantitative, la majeure partie de la sonde et ainsi permet de mesurer le nombre de copies d’ADN messagère ni leur position dans des cellules individuelles. C’est pourquoi ces méthodes ne conviennent pas quantifier la variabilité de cellule à cellule. Une technique récente basée sur une image qui permet la quantification des fois le nombre de copies d’ARN dans les cellules ainsi que leur localisation intracellulaire, appelé multiplexés hybridation in situ fluorescence erreur-robuste (MERFISH) a été mis au point. MERFISH est basé sur l’attribution d’un code à barres unique consistant en une combinaison définie d’un nombre fixe de sondes oligonucléotidiques fluorescent marqué. Ces codes barres sont lus en séries séquentielles de smFISH mesures, avec photoblanchiment après chaque ronde de l’hybridation, augmentant ainsi le débit par deux ordres de grandeur9,10. Cette technique nécessite un fluides automatisé système et la conception adéquate de l’ensemble de la sonde.
La combinaison de multiples fluorescence étiquetage des relevés de notes individuels, ainsi que des techniques de Super-résolution roman comme reconstruction optique stochastique microscopie (tempête)11, permet de décupler la résolution dans le localisation sous-cellulaire des transcriptions. Dans la tempête, une combinaison appropriée de sondes fluorescentes et tampon d’imagerie permet de multiples cycles d’émission de fluorescence par molécule de sonde (clignotant). TEMPÊTE peut également être utilisé pour l’image du transcriptome d’e. coli et observer l’organisation spatiale de génome d’ARN, par marquage simultanément toutes les transcriptions d’intérêt12.
Toutes les méthodes unicellulaires examinées ci-dessus reposent sur l’imagerie des transcriptions dans les cellules fixes. Par conséquent, ils ne fournissent pas toutes les informations concernant les propriétés cinétiques des transcriptions dans les cellules. Pour suivre les transcriptions dans des cellules vivantes13, ARNm peut être marqué par la fusion du gène d’intérêt dans un tableau des sites de liaison. Ces derniers sont alors reconnus par une protéine de liaison à l’ARN, tels que le bactériophage MS2 protéine de capside, qui est fusionnée à une protéine fluorescente comme la protéine fluorescente verte (GFP)10,14,15.
Nous décrivons ici une méthode pour l’étiquetage différents mRNAs avec un ensemble de sondes d’ADN marquées fluorescent, pour une utilisation dans des expériences de smFISH, en particulier chez e. coli. De plus, nous montrons que le même schéma d’étiquetage peut-être être utilisé pour les mesures de la tempête avec des modifications mineures.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans notre laboratoire, nous avons mesuré le nombre de transcription des gènes dans les cellules d’Escherichia coli à l’aide de la méthode de smFISH2. En bref, cette procédure se compose des étapes suivantes : fixation cellulaire, perméabilisation des membranes permettant la pénétration de la sonde, sonde d’hybridation et déguster d’imagerie à l’aide d’un microscope à fluorescence standard. Cette procédure est basée sur celles déjà publiées avec quelques modi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation Science Israël 514415 (à J.S.) et une subvention de la BSF-NSF (MCB) 2016707 (à J.S.). Support de Siegfried et Irma Ullman chaire professorale (à J.S.) est également reconnu.
Materials
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Pure Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute | Mallinckrodt Baker – Avantor | 8025.25 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free 20X SSC | Life Technologies/Ambion | AM9763 | |
| RNase-free 10X PBS | Life Technologies/Ambion | AM9625 | |
| TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, for molecular biology | Sigma-Aldrich | 93283 | |
| nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Formaldehyde solution for molecular biology, 36.5-38% in water | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Deionized formamide, nuclease free | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9342 | |
| E. coli tRNA (ribonucleic acid, transfer type xx from escherichia) | Sigma-Aldrich | R1753-500UN | |
| UltraPure BSA (50mg/ml) | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM2616 | |
| Vanadyl-ribonucleoside complex,VRC, 200 mM | New England Biolab | S1402S | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Cysteamine and oxygen | Sigma-Aldrich | 30070 | |
| Glucose Oxidase from Aspergillus niger, Type VII, 50KU | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-fucose | Sigma-Aldrich | F8150 | |
| Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | Life Technologies | V2286 | |
| Agarose,low melting reagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Adhesive silicone isolator 24-2mm Dia. X 1.8 mm depth JTR24R-A2-2.0 | Grace Bio-Labs | JTR24R-A2-2.0 666208 | |
| poly-D-lysine-coated glass bottom Glass Bottom Culture Dishes | MatTek Corporation | P35GC-1.5-14-C | |
| Super life nitrile powder free examination gloves | Supermax | TC-N-9889 | |
| Brand sterilization incubator tape | Sigma-Aldrich | BR61750 | |
| Microcentrifuge tubes (1.8 ml) | Axygen – Corning Life Sciences | MCT-175C | |
| Falcon round-bottom polypropylene tubes (14 ml) | BD Biosciences | 352059 | |
| Conical-bottom centrifuge polypropylene tubes (50 ml) | Corning | 430828 | |
| Serological pipettes (Corning 5 ml) | Corning Life Sciences | 4051 | |
| Serological pipettes (Corning 10 ml) | Corning Life Sciences | 4488 | |
| Serological pipettes (Corning 25 ml) | Corning Life Sciences | 4251 | |
| Spectrophotometer cuvettes | Sarstedt | 67.742 | |
| RNase-free pipette tips 0.2 – 20 μl | FroggaBio | FT20 | |
| RNase-free pipette tips 10 – 200 μl | Axigene/corning | TF-200 | |
| RNase-free pipette tips 100 – 1000 μl | FroggaBio | FT1000 | |
| RNase-free pipette tips 100 – 1000 μl | Sorenson | 14200 | |
| Syringe disposile 10 mL needle G-21 | Becton Dickinson, Biosciences | BD-309643 | |
| Minisart 0.2 um Syringe Filter | Sartorius | 16534 K | |
| Nikon instruments microscope type A immersion oil A, 8cc | Nikon | MXA20233 | |
| Microscope slides 76 x26, 3"x1"x1mm | Thermo Fisher Scientific | 421-004ET | |
| #0 coverslip slide 24×60 | Thermo Fisher Scientific/Menzel | BNBB024060A0 | |
| Orbital shaker | M.R.C | TOU-50 | |
| Hot block | M.R.C | ||
| Vortex | Fried Electric Company | G-560-E | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Portable Pipet-Aid XP2, Pipette Controller | Drummond Scientific Company | 4-000-501-I | |
| OD600 Spectrophotometer for Bacterial Growth Rates DiluPhotometer | Midsci | OD600-10 | |
| iXon X3 EMCCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | |
| Eclipse Ti microscope | Nikon | MEA53100 | |
| CFI plan apochromat DM 100X oil objective lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13 | Nikon | MRD31905 | |
| Filter set (TRITC/CY3): EX – ET545/30X; EM – ET620/60M; BS – T570LP | Nikon | 49005 | |
| Filter set (CY5): EX – ET640/30X; EM – ET690/50M; BS – T660P | Nikon | 49009 | |
| Nis-elements AR auto reaserch software | Nikon | MQS31000 | |
| STORM microscope | Vutara | SR-200 | |
| NA 1.2 water immersion objective | Olympus | ||
| SRX image acquisition and analysis software | Vutara | ||
| Evolve 512 EMCCD camera | Photometrics | ||
| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with CAL Fluor® Red 590 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for galK mRNA: | |||
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| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with Quaser Fluor® Red 670 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for sodB mRNA: | |||
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References
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