Site-Directed immobilizzazione della proteina morfogenetica ossea 2 a superfici solide di Click Chemistry
Summary
Biomateriali drogati con Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP2) sono stati utilizzati come una nuova strategia terapeutica per guarire fratture ossee non sindacale. Per superare gli effetti collaterali derivanti da un’incontrollabile rilascio del fattore, vi proponiamo una nuova strategia per sito-direttamente immobilizzare il fattore, creando così materiali con migliorate capacità osteogeniche.
Abstract
Diverse strategie terapeutiche per il trattamento di non-guarigione dell’osso lungo i difetti sono state studiate intensivamente. Attualmente utilizzati trattamenti presenti numerose limitazioni che hanno portato all’uso di biomateriali in combinazione con fattori di crescita osteogeniche, quali proteine morfogenetiche dell’osso (BMP). Metodi comunemente usati di assorbimento o incapsulamento richiedono quantità sovra-fisiologiche di BMP2, in genere causando un effetto di rilascio cosiddetto scoppio iniziale che provoca diversi effetti collaterali negativi gravi. Una possibile strategia per superare questi problemi sarebbe coppia covalentemente alla proteina al patibolo. Inoltre, accoppiamento deve essere eseguita in modo specifico del sito al fine di garantire un risultato riproducibile prodotto. Pertanto, abbiamo creato una variante BMP2, in cui un amminoacido artificiale (propargil-L-lisina) è stata introdotta nella parte matura della proteina BMP2 di espansione l’utilizzo di codone (BMP2-K3Plk). BMP2-K3Plk è stata accoppiata al funzionalizzati perline attraverso catalizzata rame azide-alchino cicloaddizione (CuAAC). L’attività biologica dell’accoppiata BMP2-K3Plk è stata dimostrata in vitro e l’attività osteogenica delle perle BMP2-K3Plk-funzionalizzati è stata dimostrata nelle analisi delle cellule basata. Le perline funzionalizzate a contatto con cellule C2C12 erano in grado di indurre l’espressione di fosfatasi alcalina (ALP) nella prossimità localmente limitato del tallone. Così, da questa tecnica, possono essere prodotto funzionalizzate impalcature che può innescare la differenziazione delle cellule verso una linea osteogenica. Inoltre, le dosi più basse BMP2 sono sufficienti a causa dell’orientamento controllato del sito diretta accoppiato BMP2. Con questo metodo, BMPs sono sempre esposti ai loro ricevitori sulla superficie delle cellule con l’orientamento appropriato, che non è il caso se i fattori sono accoppiati tramite tecniche di accoppiamento non-luogo-diretta. Il risultato prodotto è altamente controllabile e, quindi, risultati in materiali con proprietà omogenea, migliorando la loro applicabilità per la riparazione di dimensione critica dell’osso difetti.
Introduction
L’obiettivo finale di rigenerazione ossea del tessuto dell’osso e ingegneria è quello di superare gli svantaggi e limitazioni che si verificano durante i trattamenti comuni delle fratture non-Unione. Auto o allo trapianti sono usati principalmente come attuali strategie di terapia, anche se entrambi hanno diversi inconvenienti. L’innesto osseo ideale dovrebbe indurre osteogenesi di osteoinduzione così come osteoconduzione, conduce per l’osteointegrazione dell’innesto dell’osso. Al giorno d’oggi, solo auto-trapianto è considerato come il “gold standard”, poiché esso fornisce tutte le caratteristiche di un innesto di osso ideale. Purtroppo, esso presenta anche importanti aspetti negativi, quali tempi chirurgici lungo e un secondo sito di trauma che solitamente comporta ulteriori complicazioni (ad es., dolore cronico, formazioni di ematoma, infezioni, difetti estetici, ecc.). Trapianto allogenico, d’altra parte hanno caratteristiche non ottimali per tutti gli aspetti generali1. Tecnologie di innesto osseo alternativi sono stati migliorati negli ultimi pochi anni, con l’obiettivo di produrre impalcature che sono osteoinduttivo, osteoconduttivo, biocompatibile e bioriassorbibile. Poiché molti biomateriali non mostrare tutte queste caratteristiche osteogeniche, fattori di crescita differenti, principalmente BMP2 e BMP7, sono state integrate al fine di migliorare il potenziale osteogenico dell’ impalcatura particolare2.
Come criterio essenziale, tali sistemi di consegna di fattore di crescita dovrebbe fornire un rilascio di dose controllata nel tempo al fine di facilitare gli eventi essenziali come reclutamento di cellule e attaccamento, ricrescita delle cellule e l’angiogenesi. Tuttavia, BMPs così come altri fattori di crescita osteogeniche sono stati comunemente immobilizzato non covalentemente3. Tecniche di intrappolamento e adsorbimento richiedono l’uso di sovra-fisiologiche quantità di proteine a causa un rilascio di scoppio iniziale, che porta a gravi svantaggi in vivo, che interessa tipicamente i tessuti circostanti inducendo la crescita eccessiva dell’osso, osteolisi, gonfiore e infiammazione4. Così, la conservazione dei fattori di crescita nel sito di consegna per lunghi periodi di tempo può essere ottenuta metodi di immobilizzazione covalente. Modificati chimicamente BMP2 (succinylated5, acetilata6 o biotinilati7), ingegnerizzato eterodimeri8, o BMP2 oligopeptidi derivata9 sono stati progettati e utilizzati per superare le limitazioni relative al assorbimento. Tuttavia, la bio-attività di questi costrutti non è prevedibile, poiché la disposizione potenzialmente inibisce il legame del ligando immobilizzato ai ricevitori cellulari. Come illustrato in precedenza, è essenziale che tutte le quattro catene di recettori coinvolte nella formazione di complessi ligando-recettore attivato interagiscano con la BMP2 immobilizzato per attivare completamente tutto a valle segnalazione cascades10.
Per superare i problemi di un risultato prodotto non omogeneo con limitazioni in termini di bioattività, stabilità e biodisponibilità del fattore immobilizzato, abbiamo progettato una variante BMP in grado di legare covalentemente impalcature in maniera diretta al sito. Questa variante, definita BMP2-K3Plk, comprende un amminoacido artificiale introdotta dal codone genetica espansione11. Questa variante è stata collegata con successo a ponteggi utilizzando una strategia di accoppiamento covalente pur mantenendo la sua attività biologica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Generazione di varianti della proteina contrassegnati dall’espansione di codone genetica permette l’introduzione di vari aminoacidi non naturali analoghi principalmente in qualsiasi posizione della sequenza primaria della proteina. In caso di BMPs come BMP2, comune tag come un tag 6-istidina (sua) può solo essere presentare N-terminalmente, poiché alla fine di protein´s C-terminale è sepolto all’interno della struttura terziaria della proteina e quindi non è accessibile dall’esterno. In altre posizioni, la dimension…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il Dr. M. Rubini (Costanza, Germania) per fornire il plasmide codifica pyrrolysyl-tRNA e per la fornitura di pRSFduet-pyrtRNAsynth codifica il corrispondente aminoacyl-tRNA-sintetasi.
Materials
| Material | |||
| 1-Step NBT/BCIP | Thermo Fisher | 34042 | Add solution to cells |
| 3-Azido-7-hydroxycoumarin | BaseClick | BCFA-047-1 | Chemical used for click reaction |
| Agarose low melting point | Biozym | 840101 | Agarose for ALP assay |
| Azide agarose beads | Jena Bioscience | CLK-1038-2 | Beads used for reaction |
| BamHI (Fast Digest enzyme) | Thermo Fisher Scientific | FD0054 | Restriction enzyme |
| BMP receptor IA (BMPR-IAEC) | — | — | Produced in our lab |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 Dye | Thermo Fisher Scientific | 20279 | Chemical used for Coomassie Brilliant blue staining of SDS PAGE |
| Copper (II) sulfate anhydrous (CuSO4) | Alfa Aesar | A13986 | Chemical used for click reaction |
| DNA Polymerase and reaction buffer | Kapabiosystems | KK2102 | KAPA HiFi PCR Kit |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) GlutaMAX | Gibco | 61965-026 | Cell culture media |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich GmbH | E5134-1kg | Chemical used to stop click reaction |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Carl Roth GmbH | 2316.5 | Bacteria induction (1mM final concentration) |
| NdeI (Fast Digest enzyme) | Thermo Fisher Scientific | ER0581 | Restriction enzyme |
| NHS-activated Texas Red | Life technologies | T6134 | Coupled to receptor |
| P- Nitrophenyl Phosphate | Sigma Aldrich GmbH | N4645-1G | Alkaline Phosphatase |
| p25N-hmBMP2 | — | — | Plasmid kindly provided from Walter Sebald to J. Nickel |
| pET11a-pyrtRNA | — | — | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| propargyl-L-lysine (Plk) | — | — | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| pSRFduet-pyrtRNAsynth | — | — | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| Qiagen Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Gel Purification |
| Qiagen PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR Purification |
| Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich GmbH | A7631-100G | Chemical used for click reaction |
| T4 DNA Ligase | ThermoScientific | EL0011 | Ligation |
| tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) | BaseClick | BCMI-006-100 | Chemical used for click reaction |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma Aldrich GmbH | X100-1L | Triton X 100 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Amicon concentrating cell 400 ml | Merck KGaA | UFSC40001 | Concentrating unit |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Merck KGaA | UFC901024 | Concentrating centrifugal unit |
| ÄKTA avant FPLC | ÄKTA | — | FPLC machine |
| Avanti J-26XP | Beckman Coulter | 393124 | Centrifuge for bacterial culture |
| Bacterial Shaking Incubator | Infors HT | Shaking incubator for bacterial culture | |
| FluorChem Q system | proteinsimple | — | Imaging and analysis system for SDS-PAGE |
| Fluorescent miscroscope | Keyence | BZ-9000 (BIOREVO) | |
| Fractogel® EMD SO3– (M) | Merck KGaA | 116882 | Ion Exchange Chromatography column material |
| Greiner CELLSTAR® 96 well plates | Sigma | M5811-40EA | 96 well plates for cell culture (ALP Assay) |
| Heraeus Multifuge X1R | ThermoScientific | — | Centrifuge |
| M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor | ThermoScientific | 75003624 | Rotor for Microcentrifuge for plate during ALP staining |
| Microcentrifuge – 5417R | Eppendorf | — | Centrifuge |
| OriginPro 9.1 G | OriginLab | — | software for stastic analysis of ALP assay data |
| Polysine Slides | ThermoScientific | 10143265 | microscope slides |
| Rotor JA-10 | Beckman Coulter | — | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Rotor JLA 8.1 | Beckman Coulter | — | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Rotor JA 25.50 | Beckman Coulter | — | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Tecan infinite M200 multiplate reader | Tecan Deutschland GmbH | — | Multiplate reader for ALP assay |
| Thermocycler – Labcycler Gradient | SensoQuest GmbH | — | PCR |
| TxRed – microscope filter | Keyence | Filter for fluorescent microscope | |
| Ultrafiltration regenerated cellulose discs 3 kDa | Merck KGaA | PLBC04310 | used with amicon concentrating cell 400ml |
| Ultrafiltration regenerated cellulose discs 10 kDa | Merck KGaA | PLGC04310 | used with amicon concentrating cell 400ml |
References
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. Bone substitutes: An update. Injury. 36, S20-S27 (2005).
- Oryan, A., Alidadi, S., Moshiri, A., Bigham-Sadegh, A. Bone morphogenetic proteins: A powerful osteoinductive compound with non-negligible side effects and limitations. Biofactors. 40 (5), 459-481 (2014).
- Luginbuehl, V., Meinel, L., Merkle, H. P., Gander, B. Localized delivery of growth factors for bone repair. Eur J Pharm Biopharm. 58 (2), 197-208 (2004).
- Haidar, Z. S., Hamdy, R. C., Tabrizian, M. Delivery of recombinant bone morphogenetic proteins for bone regeneration and repair. Part A: Current challenges in BMP delivery. Biotechnol Lett. 31 (12), 1817-1824 (2009).
- Hollinger, J. O., Uludag, H., Winn, S. R. Sustained release emphasizing recombinant human bone morphogenetic protein-2. Adv Drug Deliv Rev. 31 (3), 303-318 (1998).
- Uludag, H., et al. Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: A correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model. J Biomed Mater Res. 50 (2), 227-238 (2000).
- Uludag, H., Golden, J., Palmer, R., Wozney, J. M. Biotinated bone morphogenetic protein-2: In vivo and in vitro activity. Biotechnol Bioeng. 65 (6), 668-672 (1999).
- Aono, A., et al. Potent ectopic bone-inducing activity of bone morphogenetic protein-4/7 heterodimer. Biochem Biophys Res Commun. 210 (3), 670-677 (1995).
- Suzuki, Y., et al. Alginate hydrogel linked with synthetic oligopeptide derived from BMP-2 allows ectopic osteoinduction in vivo. J Biomed Mater Res. 50 (3), 405-409 (2000).
- Knaus, P., Sebald, W. Cooperativity of binding epitopes and receptor chains in the BMP/TGFbeta superfamily. Biol Chem. 382 (8), 1189-1195 (2001).
- Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 225-249 (2006).
- Costa, G. L., Weiner, M. P. Rapid PCR site-directed mutagenesis. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
- Kirsch, T., Nickel, J., Sebald, W. Isolation of recombinant BMP receptor IA ectodomain and its 2:1 complex with BMP-2. FEBS Lett. 468 (2-3), 215-219 (2000).
- Tabisz, B., et al. Site-directed immobilization of BMP-2: Two approaches for the production of innovative osteoinductive scaffolds. Biomacromolecules. 18 (3), 695-708 (2017).
- Duong-Ly, K. C., Gabelli, S. B. Using ion exchange chromatography to purify a recombinantly expressed protein. Methods Enzymol. 541, 95-103 (2014).
- Brunelle, J. L., Green, R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).
- Kirsch, T., Nickel, J., Sebald, W. BMP-2 antagonists emerge from alterations in the low-affinity binding epitope for receptor BMPR-II. EMBO J. 19 (13), 3314-3324 (2000).
- Hein, J. E., Fokin, V. V. Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) and beyond: new reactivity of copper(I) acetylides. Chem Soc Rev. 39 (4), 1302-1315 (2010).
- Alborzinia, H., et al. Quantitative kinetics analysis of BMP2 uptake into cells and its modulation by BMP antagonists. J Cell Sci. 126 (Pt 1), 117-127 (2013).
- Paarmann, P., et al. Dynamin-dependent endocytosis of Bone Morphogenetic Protein2 (BMP2) and its receptors is dispensable for the initiation of Smad signaling. Int J Biochem Cell Biol. 76, 51-63 (2016).
- Pohl, T. L., Boergermann, J. H., Schwaerzer, G. K., Knaus, P., Cavalcanti-Adam, E. A. Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation. Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).
