अलगाव और वयस्क चूहे Cardiomyocytes की खेती
Summary
यहाँ, हम वयस्क चूहे वेंट्रिकुलर cardiomyocytes (ARVC) के अलगाव और खेती के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । पृथक ARVC छोटी और लंबी अवधि की खेती के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अलगाव और ARVC की खेती हृदय रोगों के लिए नए उपचार परहेजों को विकसित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं ।
Abstract
एक बरकरार दिल में, आसंन कोशिकाओं वयस्क cardiomyocytes प्रभाव । वयस्क cardiomyocytes के अलगाव और खेती की विधि के साथ, विशिष्ट उपचार और वातावरण के तहत इन कोशिकाओं के व्यवहार की एक सटीक जांच संभव है । यह पांडुलिपि वयस्क चूहे वेंट्रिकुलर cardiomyocytes (ARVC) के सफल अलगाव और खेती के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है ।
चूहे गहरी संज्ञाहरण के तहत गर्भाशय ग्रीवा के विस्थापन द्वारा बलिदान है । फिर, दिल निकाला जाता है और महाधमनी का पर्दाफाश किया है । इसके बाद, कैल्शियम की कमी और collagenase उपचार के साथ Langendorff छिड़काव प्रणाली पर छिड़काव किया जाता है । बाद में, वेंट्रिकुलर ऊतक भरती हो जाता है, फिर से परिचालित, और फ़िल्टर, CaCl के क्रमिक अलावा के साथ तीन केंद्रापसारक कदम द्वारा पीछा किया2 जब तक शारीरिक कैल्शियम एकाग्रता तक पहुँच जाता है. ARVC सेल कल्चरल डिश पर चढ़ाया जाता है । कोशिका संस्कृति माध्यम को ताजा करने के बाद ARVC सीरम युक्त संस्कृति माध्यम को बदले बिना छह दिनों तक खेती की जा सकती है. ARVC का अलगाव एक कैल्शियम संवेदनशील प्रक्रिया है । intracellular कैल्शियम एकाग्रता में छोटे परिवर्तन की गुणवत्ता और अलग कोशिकाओं की व्यवहार्यता में कमी के कारण ।
हौसले से पृथक ARVC रॉड के आकार के हैं । खेती के पहले दिन के भीतर वे रॉड के आकार आकृति विज्ञान और फार्म pseudopodia तरह संरचनाओं (प्रसार) खो देते हैं । इस रूपात्मक गठन के दौरान ARVC शुरू में actin तनाव फाइबर और de नोवो sarcomerogenesis के माध्यम से एक सुधार के बाद उनके सिकुड़ा तत्वों नीचा. खेती के एक सप्ताह के बाद, सबसे ARVC एक स्पष्ट रूप से पता लगाने के पार striation के साथ एक व्यापक रूप दिखा । इस प्रक्रिया को intracellular कैल्शियम एकाग्रता के प्रति संवेदनशील है, ionomycin के साथ उपचार के रूप में क्षीणन फैल. de-और पुन: विभेद की इस प्रक्रिया में कुंजी मार्कर β-मायोसिन भारी श्रृंखला (β-MHC), oncostatin M (OSM), और swiprosin-1 (EFHD2) हैं । हाल के अध्ययनों से सुझाव दिया है कि कार्डिएक फिर से और de-भेदभाव संस्कृति की स्थिति के तहत होने वाले हृदय remodeling के दौरान vivo में देखा सुविधाओं की नकल । इसलिए, अलगाव और ARVC की खेती cardiomyocytes के जीव विज्ञान को समझने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं ।
Introduction
vivo में वयस्क cardiomyocytes myocytes के बीच सेल-सेल संपर्कों के आधार पर एक इलेक्ट्रिकल syncytium के रूप में काम करते हैं । इसके अलावा, वे कार्डियक fibroblasts, endothelial कोशिकाओं, न्यूरॉन्स, और भड़काऊ कोशिकाओं की तरह आसन्न कोशिकाओं से प्रभावित कर रहे हैं1. आदेश में cardiomyocytes की क्षमता का अध्ययन करने के लिए अपने intracellular संगठन के अनुकूलन के लिए बदल लोड की स्थिति, के रूप में कार्डियक अतिवृद्धि, जो एक प्रारंभिक दिल की विफलता के लिए अग्रणी कदम है के दौरान देखा, अलगाव और वयस्क वेंट्रिकुलर चूहे की खेती cardiomyocytes (ARVC)2,3,4आवश्यक है । ऐतिहासिक, cardiomyocytes पहले भ्रूण चिकी दिल5,6से अलग थे । कुछ साल बाद, टर्मिनल विभेदित cardiomyocytes के पहले अलगाव कैल्शियम कमी7का उपयोग करके वर्णित किया गया था । हालांकि, इन वयस्क cardiomyocytes कैल्शियम सहिष्णु नहीं थे और इसलिए कार्यात्मक परख के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है । अंत में, १९७६ में एक नया प्रोटोकॉल पावेल और मोड़ सक्षम करने के लिए शारीरिक शर्तों8के तहत वयस्क वेंट्रिकुलर cardiomyocytes की जांच । पहले कदम के रूप में, वे कम कैल्शियम सांद्रता के तहत वयस्क cardiomyocytes अलग और उसके बाद एक stepwise प्रक्रिया में शारीरिक सांद्रता के लिए कैल्शियम वृद्धि हुई । आज, इस कैल्शियम प्रोटोकॉल के साथ अलगाव और वयस्क cardiomyocytes काम की खेती के लिए सबसे प्रोटोकॉल और घने सेल-सेल संपर्क के एंजाइमी पाचन के लिए collagenase का उपयोग करें1।
एक सफल खेती के लिए, भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) या oncostatin एम (OSM) की आवश्यकता है । ARVC sarcomere और सुधार सहित व्यापक संरचनात्मक परिवर्तन के साथ एक de-और फिर से भेदभाव प्रदर्शन9,10,11,12। इस प्रक्रिया को एक पुनः के साथ है भ्रूण प्रकार जीन की अभिव्यक्ति, β-मायोसिन भारी श्रृंखला (β-MHC) की तरह, के रूप में अतिवृद्धि से जाना जाता है, और pseudopodia की तरह संरचनाओं के एक गठन, भी प्रसार कहा जाता है4,11, 13. इसके अलावा, swiprosin-1 (EFHD2), एक नव पहचान प्रोटीन, फिर से खेती ARVC11के अंतर की प्रक्रिया में एक प्रमुख भूमिका निभाता है । नतीजतन, संस्कृति में ARVC व्यापक, बहुरूपी कोशिकाओं है, जो अनायास संस्कृति में दो से तीन सप्ताह के बाद संकुचन दिखाने के2,4,14में परिणत ।
हाल ही में खोजों से पता चला है कि कार्डिएक पुनः और de-भेदभाव के रूप में यह संस्कृति की स्थिति के तहत होता है vivo में कार्डिएक remodeling10,15के दौरान देखा सुविधाओं नकल । कार्डियक रिमॉडलिंग हृदय रोगों के दौरान एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है16. के रूप में हृदय रोग अभी भी औद्योगिक समाजों में मौत का मुख्य कारण हैं, वयस्क cardiomyocytes के जीवविज्ञान की एक बेहतर समझ (जो; २०१५) महत्वपूर्ण है । अलगाव और ARVC की खेती के लिए नई रणनीतियों और हृदय रोगों के उपचार के लिए दवाओं के विकास में मदद कर सकते हैं । इस पांडुलिपि के साथ, अलगाव और ARVC की खेती के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान की जाती है । इसके अलावा, इस विधि के कुछ महत्वपूर्ण भागों चर्चा अनुभाग में उजागर कर रहे हैं ।
Protocol
जांच अमेरिका के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH प्रकाशन No. 85-23, संशोधित १९९६) द्वारा प्रकाशित प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए मार्गदर्शिका के अनुसार आयोजित की जाती है । सामांय में, पुरुष wistar 3 ?…
Representative Results
Discussion
vivo में वयस्क cardiomyocytes का व्यवहार अन्य कोशिकाओं (जैसे, न्यूरॉन्स, endothelial कोशिकाओं, fibroblasts, भड़काऊ कोशिकाओं) और विद्युत syncytium जो वे फार्म1के साथ कई बातचीत से प्रभावित है. इसलिए, वयस्क cardiomyocytes का अध्ययन त?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों ने तकनीकी सहायता के लिए Woitasky और पीटर Volk को धन्यवाद दिया । इसके अतिरिक्त, लेखकों ने पांडुलिपि तैयार करने में उसकी मदद के लिए श्रीमती क्लाउडिया Lorenz (चिकित्सा लेखक, ACCEDIS) का शुक्रिया अदा किया । यह पांडुलिपि DFG (Schlu 324/7-1) द्वारा आर्थिक रूप से समर्थित थी ।
Materials
| Langendorff perfusion system | inhouse construction | double-walled with a water based heating system |
|
| Tissue chopper Mc Ilwain | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Aortic Cannula, OD 1,8 mm | inhouse construction | ||
| Abdominal shears | Aeskulap | BC772R | |
| Capsule forceps | Eickemeyer | 171307 | |
| Dissecting scissor large | Aeskulap | BC562R | |
| Dissecting scissor small | Aeskulap | BC163R | |
| Mash with Polyamid | Neolab | 4-1413 | mash size 200 μm |
| plastic disc | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Collagenase Typ II | Worthington | LS004177 |
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