ラット心筋細胞の分離と培養
Summary
ここでは、分離と培養ラット心室心筋細胞 (ARVC) のためのプロトコルを提案する.分離 ARVC は、短期および長期の栽培に使用できます。分離と ARVC の栽培は、心疾患の新しい治療法の開発に重要な役割を再生できます。
Abstract
そのままの心で隣接するセル大人の心筋細胞に影響を与えます。分離法と成人の心筋細胞の培養は、特定の治療法や環境下でこれらの細胞の動作の正確な調査が可能です。この原稿は、ラットの心室心筋細胞 (ARVC) の培養と分離を成功させるためのプロトコルを示します。
頚部転位深麻酔下でラットが犠牲に。中心部を抽出し、大動脈がカバーされていません。その後、蛍光灌流システム カルシウム枯渇とコラゲナーゼ処理の灌流が実行されます。その後、心室の組織を取得しますみじん切り、再循環、フィルター、CaCl2の段階的な追加で 3 つの遠心分離手順に続いて生理カルシウム濃度に到達するまで。ARVC 細胞培養皿にメッキパーツを多数。細胞培養液を更新した後 ARVC できます栽培される 6 日間の血清を含む培養液を変更せず。ARVC の分離は、カルシウム敏感なプロセスです。細胞内カルシウム濃度のわずかな変化は、質と隔離されたセルの実行可能性の減少を引き起こします。
新鮮な分離 ARVC は棒状のものです。栽培の最初の日以内に、彼らは、棒状形態とフォーム偽足のような構造 (拡散) を失います。この形態の形成の間に ARVC は当初改革アクチン繊維の応力およびde novo sarcomerogenesis によって続いて収縮要素を低下します。栽培の 1 週間後は、ほとんど ARVC は明確に検出可能な十字紋と広範な外観を表示します。このプロセスは細胞内カルシウム濃度に敏感イオノマイシンによる治療は拡散減衰です。Β-ミオシン重鎖 (β-MHC)、オンコスタチン M (OSM) swiprosin 1 (EFHD2)、このプロセスでのデ- と再-differentiation キー マーカー。最近の研究はことを心臓改造中に見られる生体機能模倣心臓再脱 differentiation 発生培養条件下で示唆しています。したがって、ARVC の分離と培養心筋細胞の生物学を理解する上で重要な役割を再生します。
Introduction
生体内で大人の心筋細胞間の細胞間接触に基づく電気シンシチウムとして働きます。さらに、心臓線維芽細胞、内皮細胞、神経細胞、炎症細胞1のような隣接する細胞に影響を与えています。心筋細胞の細胞内組織を適応能力を研究するために心臓肥大、心不全、分離ラット心室の栽培が主要な最初のステップみたように負荷条件を変更心筋 (ARVC) は必要な2,3,4です。歴史的には、心筋細胞最初から分離された鶏胚心5,6.数年後、終末分化した心筋細胞の最初の分離は、カルシウム枯渇7を使用して記述されていた。ただし、これらの大人の心筋細胞はカルシウム耐性をなかったし、したがって、機能アッセイには使用できませんでした。最後に、1976 年に新しいプロトコルと有効にパウエル ツイスト生理的条件8下大人の心室心筋細胞を調査します。最初のステップとして彼らは低カルシウム濃度とステップワイズ法で生理学的濃度 ca がその後増加の下で成人の心筋細胞を分離しました。今日、分離と大人の心筋細胞の培養のためのほとんどのプロトコルはこのカルシウム プロトコルで動作し、高密度細胞接触1の酵素の消化力のコラゲナーゼを使用します。
育成に成功した、牛胎児血清 (FCS) またはオンコスタチン M (OSM) が必要です。ARVC 実行、デ- と再-differentiation 筋分解と改革9,10、11,12を含む広汎な構造変更をします。このプロセスは再発現胎児型遺伝子、β-ミオシン重鎖 (β-MHC) のような伴われる拡散4,11、とも呼ばれる、偽足のような構造体の形成と肥大から知られています。13。 さらに、swiprosin-1 (EFHD2)、新たに同定されたタンパク質は栽培 ARVC11の再分化の過程で大きな役割を果たしています。その結果、文化 ARVC 文化2,4,14の 2 〜 3 週間後の収縮を自発的に表示する、広範囲にわたる多セルに変換します。
最近の発見は、心臓再脱 differentiation 模倣文化の条件下で発生すると機能を生体内で見られる心臓改造10,15時に明らかにしました。心筋リモデリングは、心疾患16の間にキーのプロセスです。心疾患は、工業化社会で死の主な原因で、まだ、大人の心筋細胞の生物学の理解を深めることが重要です (人; 2015)。ARVC の分離と培養は新たな戦略と心臓疾患の治療のための薬を開発することができます。この原稿分離 ARVC の耕作のためのプロトコルが提供されます。さらに、このメソッドのいくつかの重要な部分は、ディスカッション セクションでハイライトされます。
Protocol
Representative Results
Discussion
大人の心筋細胞生体内での挙動は他の細胞 (例えば、神経細胞、内皮細胞、線維芽細胞、炎症細胞) と電気シンシチウム彼らを形作る多くの相互作用を受けます1。したがって、分離と培養 ARVC の専ら大人の心筋細胞のストレス適応の勉強が必要です。隔離・培養 ARVC の主な効果は、: 1) 細胞外マトリックスと細胞間の連絡先から切断します。2) 収縮刺激から切断…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者ありがとうナディン Woitasky とピーター ・ ボルクのテクニカル サポート。さらに、著者は原稿を準備する彼女の助けの夫人クラウディア ローレンツ (医療ライター、ACCEDIS) をありがとうございます。この原稿は DFG (Schlu 324/7-1) によって財政上支えられます。
Materials
| Langendorff perfusion system | inhouse construction | double-walled with a water based heating system |
|
| Tissue chopper Mc Ilwain | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Aortic Cannula, OD 1,8 mm | inhouse construction | ||
| Abdominal shears | Aeskulap | BC772R | |
| Capsule forceps | Eickemeyer | 171307 | |
| Dissecting scissor large | Aeskulap | BC562R | |
| Dissecting scissor small | Aeskulap | BC163R | |
| Mash with Polyamid | Neolab | 4-1413 | mash size 200 μm |
| plastic disc | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Collagenase Typ II | Worthington | LS004177 |
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