バイオミメティック化学ニューロモデュレーション神経伝達物質グルタミン酸の in Vitroラット網膜のための方法論
Summary
このプロトコルでは、化学 wholemount ラット網膜培養神経伝達物質グルタミン酸神経の形態を調査するための手法について説明します。化学神経は網膜視細胞の変性疾患による不可逆的な失明の治療のための従来の電気神経刺激する有望な代替手段です。
Abstract
視細胞の変性疾患は、網膜の光受容細胞の進歩的な損失を取り返しのつかない失明を引き起こします。人工網膜は、人工的に患者に分かりやすい視覚認識を引き出すことを願って存続の網膜神経細胞を刺激することによって視力を回復しようとすると、視細胞の変性疾患の新たな治療法です。現在人工網膜電気網膜を刺激するが、患者にナチュラル ビジョンの高い視力の回復に相当な物理的な障壁に直面する電極の配列を使用している患者に限られた視力を回復の成功を実証しています。ネイティブの神経伝達物質を使用して化学神経生体電気に代わる刺激し、電気神経刺激を用いた人工網膜に関連する根本的な制限を回避することが可能します。具体的には、化学的神経網膜によって使用される通信と同じ自然剤神経伝達物質の非常に少量を注入することにより患者に同程度以上の visual acuities とより自然なビジョンを復元する可能性があります。化学シナプス、現在電気補綴物に比べはるかに細かい解像度で。ただし、比較的未踏刺激パラダイムとして培養網膜の化学的刺激を達成するための確立されたプロトコルではありません。この作業の目的は、網膜の化学ニューロモジュレーションの潜在的なまたは類似を勉強したい者の網膜の化学的刺激を達成するための詳細なフレームワークを提供する神経組織体外。今回、実験のセットアップと網膜神経節細胞 (RGC) スパイク応答視覚と同様の軽い応答野生型を引き出すための方法論について述べるし、注入による視細胞変性 wholemount ラット網膜のボリュームの制御ガラス マイクロ ピペットとカスタム マルチポート マイクロ流体デバイスを用いた網膜の空間に神経伝達物質グルタミン酸。この方法論とプロトコルが他の神経伝達物質やその他の神経組織を用いた神経調節のために適応する十分な一般的です。
Introduction
視細胞変性疾患、網膜色素変性症、加齢に伴う黄斑変性症などの主要な視野の損失の継承可能な原因は、現在不治1,2。これらの病気は、さまざまな特定の遺伝の突然変異から起こるが、視細胞の変性疾患はグループとして最終的に盲目を引き起こす網膜の光受容細胞の進歩的な損失によって特徴付けられます。光受容体のトリガーの広範な網膜全体改造しますが、双極細胞など、網膜の神経細胞生存の損失のままそのまま視細胞変性3 の高度な段階でも比較的機能、4,5,6,7。
メカニズムとこれらの疾患の病態はよく特徴付けられて3,4,5,6,7をされているが、効果的な治療法は、とらえどころのないままです。過去 3 年間、世界中の研究者が視細胞変性疾患遺伝子療法8、幹細胞治療9を含む影響を受けた人々 に視力を回復のための治療のさまざまなを検討しました。網膜移植10、および存続の網膜ニューロンの人工的な刺激11,12 。これらの最も臨床的に利用可能な従来の目標を特定のパターンで双極細胞または Rgc を電気刺激するために電極の配列を利用して人工神経機器である人工患者11人工視覚認識を作成します。アーガス II13アルファ IMS14デバイスなどの現在の世代電気補綴臨床承認を達成しているし、復元することによって患者の生活の質を改善できるという予備調査は示した、網膜 (網膜の前面) 上と subretinal 視 (網膜) 背の測定デバイス15,16を注入しました。世界中の研究グループはこれらの第一世代のデバイス17,18,19,20の成功を超えて人工網膜の進展に取り組んでいるが、直面しています。電気の義足患者への法的な失明レベル以下高視力視力の回復が可能の設計の難しさ。最近の調査は示したこと安全に刺激するために大規模な電極の使用が余儀無くされる電荷注入制限のため人工の電気ベースは挑戦により、現在の世代よりも高分解能を達成するため、空間分解能、すなわち視力11,21を犠牲にして網膜神経細胞。さらに、電気刺激はさらに主な理由はそれが本質的に不自然な刺激パラダイム21それは通常近くのすべてのセルを刺激し、したがって患者では、不自然と混乱の認識を引き出すために、制限します。それにもかかわらず、電気刺激の初期の成功は、その人工の神経は、視細胞の変性疾患の効果的な治療をすることができますを示しています。これはさらに効果的な治療は、神経伝達物質の化学物質、化学シナプスでコミュニケーションの自然なエージェントと網膜を刺激することによって達成可能なかもしれないことを仮定する 1 つを導きます。本稿で紹介した方法の目的は、化学的刺激、生体電気に代わる刺激として、網膜の神経細胞間のシナプス通信の自然のシステムを模倣するように努めるの治療の可能性を探索するには人工。
化学人工網膜へ治療の化学刺激の概念の翻訳はネイティブ神経伝達物質のグルタミン酸塩、マイクロを介してリリースなど少量でターゲット網膜神経細胞を化学的に活性化に依存しています。視覚刺激への応答で microports の大規模な配列を構成するデバイス。このように、化学人工になる自然化学信号を網膜に達する光子を変換するバイオミメティック人工視細胞層本質的に。これらの化学信号通常網膜シグナル伝達に利用されている同じ神経伝達物質を使用し、正常な視力経路、結果として得られる visual によって使用される同じシナプス経路を介して変性網膜の存続の網膜神経細胞を刺激するので化学の人工網膜を通じた知覚可能性がありますより自然で分かりやすい 1 つを介して電気的人工誘発に比べています。さらに、非常に小さく、電極とは異なり、高密度に配列した神経伝達物質を解放する microports を行うことができますので潜在的な化学補綴できるかもしれないより焦点刺激を達成するために高い空間電気義足より解像度。したがって、これらの潜在的な利点に基づいて、化学人工網膜は電気義足に非常に有望な代替手段を提供しています。
網膜の化学的刺激、検討されている比較的少し最近まで。一方、網膜の電気刺激は体外22,23、生体内で23,24、および臨床研究13 を通じて仕事の十年にわたっても特徴とされています。 ,14, 化学的刺激の研究はいくつかの in vitro作品25,26,27,28に排他的に限定されています。梨田と Finlayson26と過激派ら27は、網膜上の網膜培養網膜ニューロンのグルタミン酸誘発反応を記録する単一電極と電極 (MEA) をそれぞれ、使用して化学的刺激を示した。もっと最近、ラウントゥリーら28は、網膜上の複数のサイトから神経細胞の反応を記録する網膜側と MEA からグルタミン酸を使用してオフにして網膜の経路の差の刺激を示した。更なる研究が多くを調べることが不可欠であるが、これらの作品は予め化学的刺激の可能性を確立して、このアプローチ以外の側面に対処ところ25,26,27,28、前述の通り化学人工網膜にこの概念を翻訳する前に両方の in vitroとin vivoの動物モデルで治療刺激パラメーターを微調整します。しかし、現在本邦網膜の化学的刺激を達成するための確立された方法論がない、そのような細部で以前の作品で使用される方法が記載されていない複製研究のために不可欠になります。したがって、メソッド本の根拠体外前研究27を複製するどちらかに興味がある研究者の網膜の化学的刺激を実施するための適切に定義されたフレームワークを提供することです。 28または化学神経のこの初期のコンセプトをさらに進めます。
Wholemount 網膜視細胞変性の進行を密接に模倣視細胞変性ラット モデルおよび野生型ラットの網膜神経細胞の化学的刺激培養を行うためのメソッドを示す人間の病気。生体外モデルでこの刺激法の開発の背後にある理論的根拠はさまざまな刺激パラメーターの治療の範囲を評価してが不可能または困難でで観察する神経応答特性に関する研究vivoモデルでは、初期の研究、特に中に焦点を当てたこのアプローチの可能性を評価します。この手順では市販のシングル ポート ガラス マイクロ ピペットとカスタムを介してターゲット網膜近く 1 mM グルタミン酸の少量を提供することにより網膜のシングル サイトと同時複数サイトの化学的刺激を表示します。マイクロ多ポート マイクロ流体デバイスをそれぞれ。一方、単一サイト、複数サイトの両方の刺激は、化学神経の治療の可能性の調査の基本的な目的を達成する、それぞれはユニークな利点と異なる目的を果たします。市販の予ガラス マイクロ ピペットを達成する可能性があります、単一サイト刺激単一サイトで網膜の地下に直接化学物質を注入するため、オブザーバブル RGC スパイク率を調査する提供しています視覚誘発の光応答に似た応答は、注射部位の下で先んじて誘発されることができます。その一方で、マルチサイト刺激を特殊加工したマルチポート マイクロ流体デバイスを必要とする網膜の表面に複数のサイトで空間的化学物質を注入するため、どれだけグルタミン酸誘発 RCG を調査するのに役立つ応答パターンはパターン刺激研究におけるグルタミン酸噴射パターンに対応します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで紹介した方法は、前記網膜神経細胞は化学的に網膜体外の地下にネイティブの神経伝達物質の化学物質を注入することによって刺激されるユニークな神経刺激パラダイムを示します。この化学刺激テクニック選択性高い焦点ターゲット ニューロン特異性など従来の電気刺激法をいくつかの利点を提供しています。上記の詳細をどのように小さなターゲット網膜神経細胞のいずれ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本稿で仕事に支えられた全米科学財団、研究の新たなフロンティアとイノベーション (NSF-年度に新設された) プログラム許可番号 0938072。本稿の内容は著者の責任であり、NSF の公式見解を必ずしも表さない。著者はまた彼の仕事の設計とテストの化学刺激の初期の実験のセットアップおよび氏 Ashwin ラグーネイサンで使用するマルチポート マイクロ流体デバイスを評価の設計、製造、および彼の仕事のための博士国内過激派を感謝したいです。本研究では。
Materials
| Microelectrode array, perforated layout | Multi Channel Systems, GmbH | 60pMEA200/30iR-Ti-pr | http://www.multichannelsystems.com/products/microelectrode-arrays/60pmea20030ir-ti |
| MEA amplifier | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv |
| Bottom perfusion groundplate for pMEA | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv-(BC)-PGP | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv-bc-pgp |
| 3-axis Motorized Micromanipulator | Sutter Instruments, Novato, CA | MP-285 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mp285.html |
| Micromanipulator Control System | Sutter Instruments, Novato, CA | MPC-200 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mpc200.html |
| Gantry style micromanipulator stand with linear slide | Sutter Instruments, Novato, CA | MT-75/LS | https://www.sutter.com/STAGES/mt75.html |
| 8-channel Programmable Multichannel Pressure Injector | OEM: MicroData Instrument, S. Plainfield, NJ Vendor: Harvard Apparatus UK |
PM-8000 or PM-8 | OEM: http://www.microdatamdi.com/pm8000.htm Vendor: https://www.harvardapparatus.co.uk/webapp/wcs/stores/servlet/product_11555_10001_39808_-1_HAUK_ProductDetail |
| Axopatch 200A Integrating Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Axopatch 200A | Axopatch 200A has been replaced with a newer model Axopatch 200B: https://www.moleculardevices.com/systems/axon-conventional-patch-clamp/axopatch-200b-amplifier |
| Patch clamp headstage | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV 201A | http://mdc.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/16554/~/axopatch-200a%3A-selection-cv-headstage |
| Vacuum waste kit | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VMK | http://alascience.com/product/vacuum-waste-kit/ |
| Pipette holder | Warner Instruments, Hamden, CT | QSW-A10P | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=915 |
| Pre-pulled 10 μm tip diameter glass micropipettes | World Precision Instruments, Sarasota, FL | TIP10TW1 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/make-selection-pre-pulled-glass-pipettes-plain/ |
| Zoom stereomicroscope | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ-745T | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ745 |
| Microscope boom stand with dual linear ball bearing arm | Old School Industries, Inc., Dacono, CO | OS1010H-16BB | http://www.osi-incorp.com/productdisplay/dual-linear-ball-bearing-arm |
| Zoom Stereo Microscope with C-LEDS Hybrid LED Stand | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ-445 | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ445 |
| Inverted microscope system | Nikon, Tokyo, Japan | Eclipse Ti-E | https://www.nikoninstruments.com/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-Ti-E |
| Ames medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1420 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a1420 |
| L-Glutamic Acid (Glutamate) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/100291 |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S8761 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8761 |
| 60 mm Petri dish (10 mm tall) | Fischer Scientific, Waltham, MA | FB0875713A | 60 mm clear petri dish; https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875713a |
| Jewelers #5 Forceps | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 555227F | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/555227f-jewelers-5-forceps-11cm-straight-titanium/ |
| Standard Scalpel Blad #24 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500247 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500247-standard-scalpel-blade-24/ |
| Scalpel Handle #4 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500237 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500237-scalpel-handle-4-14cm/ |
| Vannas Tubingen Dissection Scissors | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 503378 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/503378-vannas-tubingen-scissors-8cm-straight-german-steel/ |
| Nylon mesh kit | Warner Instruments, Hamden, CT | NYL/MESH | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=1173 |
| Harp slice grid | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | HSG-5AD | http://alascience.com/product/standard-harp-slice-grids/ |
| Ag/AgCl reference electrode pellet | Multi Channel Systems, GmbH | P1060 | http://www.multichannelsystems.com/products/p1060 |
| 4 Channel Valve Controlled Gravity Perfusion System | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VC3-4xG | http://alascience.com/product/4-channel-valve-controlled-gravity-perfusion-system/ |
| Zyla 5.5 sCMOS microscope camera | Andor Technology, Belfast, UK | Zyla 5.5 sCMOS | http://www.andor.com/scientific-cameras/neo-and-zyla-scmos-cameras/zyla-55-scmos |
| Silver wire (50 μm diameter) | Fischer Scientific, Waltham, MA | AA44461G5 | https://www.fishersci.com/shop/products/silver-wire-0-05mm-0-002-in-dia-annealed-99-99-metals-basis-3/aa44461g5 |
| Tygon microbore tubing (1.6 mm diameter) | Cole Parmer, Vernon Hills , IL | EW-06419-01 | https://www.coleparmer.com/i/tygon-microbore-tubing-0-020-x-0-060-od-100-ft-roll/0641901 |
| Tilting Tool Holder with Steel Cannula | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | TILTPORT | One each of these were utilized for top perfusion and suction; http://alascience.com/product/tilting-tool-holder-with-steel-cannula/ |
| Roscolux #26 Light Red Filter Sheet | Rosco Laboratories Inc., 52 Harbor View, Stamford, CT | R2611 | Manufacturer: http://us.rosco.com/en/products/catalog/roscolux Vendor: https://www.bhphotovideo.com/c/product/43957-REG/Rosco_RS2611_26_Filter_Light.html |
| Smith & Wesson Galaxy Red Flashlight | Smith & Wesson, 2100 Roosevelt Avenue, Springfield, MA | 4588 | Manufacturer: https://www.smith-wesson.com/ Vendor: http://www.mypilotstore.com/mypilotstore/sep/4588 |
| MC_Rack Software | Multi Channel Systems, GmbH | MC_Rack | http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack |
| Labview Software | National Instruments, Austin, TX | LabVIEW | http://www.ni.com/labview/ |
| NIS-Elements: Basic Research Software | Nikon, Tokyo, Japan | NIS-Elements BR | https://www.nikoninstruments.com/Products/Software/NIS-Elements-Basic-Research |
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