Méthodologie pour la chimie biomimétique Neuromodulation des rétines de Rat avec le neurotransmetteur Glutamate In Vitro
Summary
Ce protocole décrit une nouvelle méthode pour étudier une forme de neurostimulation chimique de wholemount rat rétines in vitro avec le neurotransmetteur glutamate. Neurostimulation chimique est une alternative prometteuse à la neurostimulation électrique conventionnelle des neurones de la rétine pour traiter la cécité irréversible causée par des maladies dégénératives de photorécepteurs.
Abstract
Maladies dégénératives photorécepteur causent la cécité irréparable par la perte progressive des cellules photoréceptrices de la rétine. Prothèses rétiniennes sont un traitement émergent pour les maladies dégénératives de photorécepteurs qui visent à restaurer la vision en stimulant artificiellement les neurones rétiniens survivants dans l’espoir de susciter une perception visuelle compréhensible chez les patients. Prothèses rétiniennes actuels ont fait preuve de succès dans le rétablissement de la vision limitée aux patients utilisant un tableau d’électrodes pour électriquement stimule la rétine mais font face à des obstacles physiques considérables pour restaurer l’acuité élevée, une vision naturelle aux patients. Neurostimulation chimique à l’aide de neurotransmetteurs natives est une stimulation alternative électrique biomimétique et pourrait contourner les limitations fondamentales associées à des prothèses rétiniennes à l’aide de neurostimulation électrique. Plus précisément, neurostimulation chimique a le potentiel de restaurer une vision plus naturelle avec acuités comparables ou supérieure aux patients par l’injection de très faibles quantités de neurotransmetteurs, les mêmes agents naturels de communication utilisés par la rétine produit chimique synapses, à une résolution beaucoup plus fine que les prothèses électriques actuels. Cependant, comme un paradigme de stimulation relativement inexploré, il n’y a aucun protocole pour parvenir à la stimulation chimique de la rétine en vitro. Le but de ce travail est de fournir un cadre détaillé pour l’accomplissement de la stimulation chimique de la rétine pour les chercheurs qui souhaitent étudier le potentiel de neuromodulation chimique de la rétine ou similaire des tissus neuraux in vitro. Dans ce travail, nous décrivons le montage expérimental et la méthodologie pour ganglionnaires rétiniennes cellulaire (RGC) spike réponses similaire à visual réactions légères en sauvage et wholemount photorécepteur-dégénéré rétine de rat en injectant contrôlée des volumes de le neurotransmetteur glutamate dans l’espace sous-rétinienne utilisant des micropipettes de verre et un dispositif microfluidique multiport personnalisé. Cette méthodologie et le protocole sont assez générales pour être adapté à la neuromodulation à l’aide d’autres neurotransmetteurs ou même d’autres tissus nerveux.
Introduction
Photorécepteurs des affections dégénératives, comme la rétinite pigmentaire et la dégénérescence maculaire liée à l’âge, sont en tête des causes héréditaires de perte de vision et sont actuellement incurables1,2. Bien que ces maladies proviennent d’une variété de mutations génétiques spécifiques, maladies dégénératives photorécepteurs sont caractérisés en tant que groupe par la perte progressive des cellules photoréceptrices de la rétine, qui finit par provoquer la cécité. La perte des déclencheurs de photorécepteurs généralisées transformant tout au long de la rétine, mais survivre les neurones de la rétine, y compris les cellules bipolaires et CGR, restent intactes et relativement fonctionnel même à un stade avancé de photorécepteur dégénérescence3 ,4,5,6,7.
Les mécanismes et les pathologies de ces maladies ont été bien caractérisé3,4,5,6,7 , mais un traitement efficace demeure insaisissable. Durant les trois dernières décennies, les chercheurs dans le monde entier ont étudié une variété de traitements thérapeutiques pour restaurer la vision de personnes atteintes de maladies dégénératives photoréceptrices dont gene therapy8, cellules souches traitement9, rétinienne transplantation10et stimulation artificielle11,12 des neurones rétiniens survivants. Parmi ceux-ci, le plus cliniquement disponibles sont des prothèses rétiniennes, qui sont des dispositifs de neurostimulation artificiels qui ont traditionnellement utilisé un tableau des électrodes pour stimuler électriquement les CGR ou cellules bipolaires en modèles spécifiques dans le but de création artificielles perceptions visuelles dans les patients11. Prothèses électriques de génération actuelle, comme l’Argus II13 et les Alpha-IMS14 périphériques, ont obtenu l’approbation clinique et des études préliminaires ont indiqué qu’ils peuvent améliorer la qualité de vie des patients en rétablissant une mesure de la vision à l’aide de deux épirétinienne (avant de la rétine) et subretinal (l’arrière de la rétine) implantés dispositifs15,16. Groupes de recherche du monde entier travaillent sur l’avancement des prothèses rétiniennes au-delà du succès de ces dispositifs de première génération17,18,19,20 , mais ont été confrontés à difficultés de conception d’une prothèse électrique capable de restaurer la vision acuité élevée au-dessous du niveau de cécité légale aux patients. Des études récentes ont montré que parvenir à une résolution spatiale supérieure à celle activée par la génération actuelle électrique basé sur prothèses est difficile en raison de la limite d’injection de charge, qui nécessite l’utilisation de grandes électrodes pour stimuler en toute sécurité neurones de la rétine au détriment de la résolution spatiale, c’est-à-dire l’acuité visuelle de11,21. En outre, la stimulation électrique est en outre limitée parce qu’elle stimule généralement toutes les cellules voisines et par conséquent suscite des perceptions peu naturelle et source de confusion chez les patients, en grande partie parce que c’est un paradigme de stimulation par nature contre nature21. Néanmoins, les premiers succès de la stimulation électrique ont démontré que cette neurostimulation artificielle peut être un traitement efficace pour les maladies dégénératives de photorécepteurs. Cela nous amène à émettre l’hypothèse qu’un traitement encore plus efficace pourrait être réalisable en stimulant la rétine avec des neurotransmetteurs produits chimiques, les agents naturels de communication aux synapses chimiques. La méthode présentée dans cet article vise à explorer la faisabilité thérapeutique de la stimulation chimique, qui cherche à imiter le système naturel de communication synaptique entre les neurones de la rétine, comme une stimulation alternative électrique biomimétique pour une prothèse de rétine.
Traduction de la notion de stimulation chimique thérapeutique d’une prothèse de rétine chimique dépend chimiquement activation des neurones rétiniens cible avec de petites quantités de neurotransmetteurs indigènes, comme le glutamate, libéré par un microfluidique dispositif comprenant un large éventail de microports en réponse à des stimuli visuels. De cette façon, une prothèse de rétine chimique serait essentiellement une couche de photorécepteur artificielle biomimétique qui se traduit par des photons naturellement pour atteindre la rétine aux signaux chimiques. Étant donné que ces signaux chimiques utilise les mêmes neurotransmetteurs utilisés dans la signalisation rétinienne normale et stimuler les neurones de la rétine survivants d’un dégénéré de la rétine à travers les mêmes voies synaptiques utilisée par les voies de la vision normale, le visuel qui en résulte perception grâce à une prothèse de rétine chimique pourrait être plus naturelle et compréhensible par rapport à un évoquée à travers une prothèse électrique. En outre, depuis le microports à travers lequel les neurotransmetteurs sont libérés peuvent être fait extrêmement petites et rangées à haute densité, à la différence des électrodes, un potentiel chimique prothétique peut être capable d’atteindre plus de stimulation focal et plus spatiale résolution à une prothèse électrique. Ainsi, une prothèse de rétine chimique basé sur ces avantages potentiels, offre une alternative très prometteuse à prothèses électriques.
La stimulation chimique de la rétine, cependant, a été relativement peu explorée jusqu’à une date récente. Alors que la stimulation électrique de la rétine a été bien caractérisée au cours de décennies de travail par le biais de in vitro22,23, in vivo23,24et des études cliniques13 ,14, études sur la stimulation chimique ont été limités exclusivement à quelques in vitro travaux25,26,27,28. Iezzi et Finlayson26 et Inayat et al. 27 a démontré épirétinienne stimulation chimique de la rétine in vitro en utilisant une seule électrode et un tableau multiélectrodes (MEA), respectivement, d’enregistrer les réponses de glutamate évoquée par des neurones de la rétine. Plus récemment, Rountree et al. 28 a démontré la stimulation différentielle des voies marche rétiniennes à l’aide de glutamate du côté sous-rétinienne et un AME pour enregistrer les réponses neuronales de plusieurs sites sur la rétine.Bien que ces travaux ont établi préalablement la faisabilité de la stimulation chimique, plus amples études sont essentielles pour enquêter sur plusieurs aspects de cette approche au-delà de celles adressées jusqu’à25,26,27 , 28et d’affiner les paramètres de stimulation thérapeutique dans des modèles animaux in vitro et in vivo avant de traduire ce concept à une prothèse de rétine chimique tel que discuté ci-dessus. Cependant, actuellement, il n’y a aucune méthodologie établie pour l’accomplissement de la stimulation chimique de la rétine dans la littérature et les méthodes utilisées dans les travaux antérieurs n’ont pas été décrits en détail comme ce serait essentiel pour études réplicatifs. La raison d’être de cet article des méthodes est donc de fournir un cadre bien défini pour la conduite in vitro la stimulation chimique de la rétine pour les chercheurs intéressés dans la reproduction de nos précédentes études27, soit 28 , ou encore faire progresser ce concept naissant de la neurostimulation chimique.
Nous démontrons une méthode pour la réalisation in vitro la stimulation chimique des neurones de la rétine dans la wholemount de rétine de rat sauvage et un modèle de rat dégénérées de photorécepteurs qui imite étroitement la progression du photorécepteur dégénérative maladies chez les humains. La raison d’être de développer cette méthode de stimulation dans des modèles in vitro consiste à évaluer les gammes thérapeutiques divers paramètres de stimulation et d’étudier les caractéristiques de la réponse neuronale qui seraient impossibles ou difficiles à observer dans dans vivo modèles, surtout pendant les premières études axées sur l’évaluation de la faisabilité de cette approche. Nous montrons dans cette procédure, site unique et simultanées sur plusieurs sites des stimulations chimiques des rétines en livrant des petites quantités de glutamate 1 mM près de neurones rétiniens cible via micropipettes verre disponible dans le commerce de port unique et personnalisée dispositif de micro-usines de microfluidique multi-ports, respectivement. Alors que les stimulations fois site unique et multi-sites accomplir l’objectif fondamental d’étudier la faisabilité thérapeutique de neuromodulation chimique, chacun répond à un objectif distinct avec un avantage unique. La stimulation d’un site unique, qui peut être accomplie avec micropipettes verre tiré préalablement disponibles dans le commerce, peut être utilisée pour injecter des produits chimiques directement dans le sous-sol de la rétine sur un seul site et sert à vérifier si RGC observable spike taux les réponses qui ressemblent à des réponses légers visuellement évoquées peuvent être déclenchés focalement sous le site de l’injection. En revanche, la stimulation multisite, qui exige un dispositif microfluidique multiport spécialement fabriquées, peut être utilisée pour injecter des produits chimiques dans l’espace à de nombreux endroits sur la surface de la rétine et sert à étudier comment bien évoquée par le glutamate RCG profils de réponse correspondent aux modèles injection glutamate dans les études de stimulation modèle.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode présentée ici montre un paradigme unique stimulation neurale, dans laquelle les neurones de la rétine sont stimulés chimiquement par injection de produits chimiques native neurotransmetteur dans le sous-sol de la rétine in vitro. Cette technique de stimulation chimique offre plusieurs avantages sur la technique de stimulation électrique conventionnelle, dont la sélectivité et une grande spécificité focale des neurones de la cible. Le protocole au-dessus de détails comment petits volume pne…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le travail présenté dans le document a été pris en charge par la National Science Foundation, nouvelles frontières dans la recherche et le programme d’Innovation (NSF-EFRI) accorde nombre 0938072. Le contenu de ce document n’engagent que la responsabilité des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les vues officielles de la NSF. Les auteurs souhaitent également remercier Dr Samsoon Inayat pour son travail, concevoir et tester l’installation expérimentale initiale pour la stimulation chimique et M. Ashwin Raghunathan pour son travail de conception, fabrication et évaluer le dispositif microfluidique multiport utilisé dans Cette étude.
Materials
| Microelectrode array, perforated layout | Multi Channel Systems, GmbH | 60pMEA200/30iR-Ti-pr | http://www.multichannelsystems.com/products/microelectrode-arrays/60pmea20030ir-ti |
| MEA amplifier | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv |
| Bottom perfusion groundplate for pMEA | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv-(BC)-PGP | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv-bc-pgp |
| 3-axis Motorized Micromanipulator | Sutter Instruments, Novato, CA | MP-285 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mp285.html |
| Micromanipulator Control System | Sutter Instruments, Novato, CA | MPC-200 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mpc200.html |
| Gantry style micromanipulator stand with linear slide | Sutter Instruments, Novato, CA | MT-75/LS | https://www.sutter.com/STAGES/mt75.html |
| 8-channel Programmable Multichannel Pressure Injector | OEM: MicroData Instrument, S. Plainfield, NJ Vendor: Harvard Apparatus UK |
PM-8000 or PM-8 | OEM: http://www.microdatamdi.com/pm8000.htm Vendor: https://www.harvardapparatus.co.uk/webapp/wcs/stores/servlet/product_11555_10001_39808_-1_HAUK_ProductDetail |
| Axopatch 200A Integrating Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Axopatch 200A | Axopatch 200A has been replaced with a newer model Axopatch 200B: https://www.moleculardevices.com/systems/axon-conventional-patch-clamp/axopatch-200b-amplifier |
| Patch clamp headstage | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV 201A | http://mdc.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/16554/~/axopatch-200a%3A-selection-cv-headstage |
| Vacuum waste kit | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VMK | http://alascience.com/product/vacuum-waste-kit/ |
| Pipette holder | Warner Instruments, Hamden, CT | QSW-A10P | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=915 |
| Pre-pulled 10 μm tip diameter glass micropipettes | World Precision Instruments, Sarasota, FL | TIP10TW1 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/make-selection-pre-pulled-glass-pipettes-plain/ |
| Zoom stereomicroscope | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ-745T | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ745 |
| Microscope boom stand with dual linear ball bearing arm | Old School Industries, Inc., Dacono, CO | OS1010H-16BB | http://www.osi-incorp.com/productdisplay/dual-linear-ball-bearing-arm |
| Zoom Stereo Microscope with C-LEDS Hybrid LED Stand | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ-445 | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ445 |
| Inverted microscope system | Nikon, Tokyo, Japan | Eclipse Ti-E | https://www.nikoninstruments.com/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-Ti-E |
| Ames medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1420 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a1420 |
| L-Glutamic Acid (Glutamate) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/100291 |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S8761 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8761 |
| 60 mm Petri dish (10 mm tall) | Fischer Scientific, Waltham, MA | FB0875713A | 60 mm clear petri dish; https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875713a |
| Jewelers #5 Forceps | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 555227F | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/555227f-jewelers-5-forceps-11cm-straight-titanium/ |
| Standard Scalpel Blad #24 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500247 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500247-standard-scalpel-blade-24/ |
| Scalpel Handle #4 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500237 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500237-scalpel-handle-4-14cm/ |
| Vannas Tubingen Dissection Scissors | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 503378 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/503378-vannas-tubingen-scissors-8cm-straight-german-steel/ |
| Nylon mesh kit | Warner Instruments, Hamden, CT | NYL/MESH | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=1173 |
| Harp slice grid | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | HSG-5AD | http://alascience.com/product/standard-harp-slice-grids/ |
| Ag/AgCl reference electrode pellet | Multi Channel Systems, GmbH | P1060 | http://www.multichannelsystems.com/products/p1060 |
| 4 Channel Valve Controlled Gravity Perfusion System | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VC3-4xG | http://alascience.com/product/4-channel-valve-controlled-gravity-perfusion-system/ |
| Zyla 5.5 sCMOS microscope camera | Andor Technology, Belfast, UK | Zyla 5.5 sCMOS | http://www.andor.com/scientific-cameras/neo-and-zyla-scmos-cameras/zyla-55-scmos |
| Silver wire (50 μm diameter) | Fischer Scientific, Waltham, MA | AA44461G5 | https://www.fishersci.com/shop/products/silver-wire-0-05mm-0-002-in-dia-annealed-99-99-metals-basis-3/aa44461g5 |
| Tygon microbore tubing (1.6 mm diameter) | Cole Parmer, Vernon Hills , IL | EW-06419-01 | https://www.coleparmer.com/i/tygon-microbore-tubing-0-020-x-0-060-od-100-ft-roll/0641901 |
| Tilting Tool Holder with Steel Cannula | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | TILTPORT | One each of these were utilized for top perfusion and suction; http://alascience.com/product/tilting-tool-holder-with-steel-cannula/ |
| Roscolux #26 Light Red Filter Sheet | Rosco Laboratories Inc., 52 Harbor View, Stamford, CT | R2611 | Manufacturer: http://us.rosco.com/en/products/catalog/roscolux Vendor: https://www.bhphotovideo.com/c/product/43957-REG/Rosco_RS2611_26_Filter_Light.html |
| Smith & Wesson Galaxy Red Flashlight | Smith & Wesson, 2100 Roosevelt Avenue, Springfield, MA | 4588 | Manufacturer: https://www.smith-wesson.com/ Vendor: http://www.mypilotstore.com/mypilotstore/sep/4588 |
| MC_Rack Software | Multi Channel Systems, GmbH | MC_Rack | http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack |
| Labview Software | National Instruments, Austin, TX | LabVIEW | http://www.ni.com/labview/ |
| NIS-Elements: Basic Research Software | Nikon, Tokyo, Japan | NIS-Elements BR | https://www.nikoninstruments.com/Products/Software/NIS-Elements-Basic-Research |
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