Auditieve Brainstem Response en buitenste Haarcel geheel-cel Patch klem opname bij postnatale ratten
Summary
Dit protocol wordt beschreven methoden om vast te leggen van de auditieve brainstem response van postnatale rat pups. Om te onderzoeken de functionele ontwikkeling van buitenste haarcellen, is de experimentele procedure van geheel-cel patch klem opnemen in geïsoleerde buitenste haarcellen stapsgewijze beschreven.
Abstract
De buitenste Haarcel is één van de twee soorten zintuiglijke haarcellen in het slakkenhuis van zoogdieren. Ze veranderen de lengte van hun cellen met de receptor potentieel aan het vergroten van de zwakke trilling van low-level geluidssignaal. De morfologie en elektrofysiologische eigenschap van de buitenste haarcellen (OHCs) ontwikkelen in vroege postnatale leeftijden. De rijping van buitenste Haarcel kan bijdragen aan de ontwikkeling van het auditieve systeem. Het proces van OHCs ontwikkeling is echter niet goed bestudeerd. Dit is deels vanwege de moeilijkheid om het meten van hun functie door een elektrofysiologische aanpak. Met als doel het ontwikkelen van een eenvoudige methode om de bovengenoemde kwestie, beschrijven hier we een stapsgewijze protocol om te bestuderen van de functie van OHCs in acuut gedissocieerde slakkenhuis van postnatale ratten. Met deze methode kunnen we evalueren de cochleair reactie op zuivere Toon stimuli en onderzoeken of het niveau van expressie en functie van de motor eiwit-prestin in OHCs. Deze methode kan ook worden gebruikt om te onderzoeken van de binnenste haarcellen (IHCs).
Introduction
Twee afzonderlijke functies van cochleair zintuiglijke haarcellen zijn essentieel voor zoogdieren hoorzitting: mechanoelectric transductie (BMO) en electromotility1,2. Door BMO kanalen bevindt zich in de haar bundel, IHCs (IHCs) en OHCs converteren geluid trillingen in membraan potentiële wijzigingen, alsmede de elektrische signalen van bezenuwde spiraalvormige ganglion neuronen. OHCs wijzigen van de lengte van hun cellen met de membraanpotentiaal en versterken de trillingen van laag niveau geluid. Deze activiteit genoemd electromotility is afgeleid van de prestin van de motor eiwit gelegen in de laterale wand van OHCs3.
In vele soorten, met inbegrip van knaagdieren, is het gehoor onvolwassen in vroege postnatale epoch4,5. Geen actiepotentiaal in reactie op sound ‘-signalen kunnen worden opgespoord in de auditieve cortex vóór de hoorzitting begin6,7. Ontwikkeling van de morfologie en functie van het slakkenhuis is veel onderzocht in gerbil, muis en rat4,5,8. De mechanotransduction en de electromotility van haarcellen worden ook ontwikkeld in de vroege leven epoch5.
Om te evalueren van de gevoeligheid van de hoorzitting van ratten op verschillende postnatale leeftijden, hebben we een methode voor auditieve brainstem response (ABR) opname in rat pups ontwikkeld. Geheel-cel patch klem is een ideale technologie te onderzoeken van de OHCs electrophysiologically. Echter, vergeleken met de patch klem uitgevoerd in neuronen en andere epitheliale cellen, het lage tarief van geheel-cel afdichting beperkt het onderzoek van electromotility van geïsoleerde OHCs.
Hier beschrijven we een procedure voor het onderzoek naar de OHCs morfologisch en electrophysiologically in acuut gedissocieerde slakkenhuis van postnatale ratten. Deze methode kan worden aangepast voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen die binnenste Haarcel ontwikkeling en functie regelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bij ratten jonger dan dag 11, kon geen actiepotentiaal in reactie op geluid stimulatie worden waargenomen in de auditieve cortex6,7. Daarom, postnatale dag 11 wordt beschreven als “hoorzitting begin”10. De ontwikkeling van gehoor voordat hoorzitting begin was niet goed nog onderzocht. Met de soortgelijke methode voor volwassen ABR opname, we laten zien dat de ABR’s kunnen worden ontlokte door zuivere Toon burst van rat pups jonger dan P11 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door subsidies van het 973 programma (2014CB943002) en de nationale Natural Science Foundation van China (11534013, 31500841).
Materials
| Anesthetic | |||
| Pentobarbital sodium | Sigma | P3761 | 1.5% in water |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection solution | |||
| Leiboviz's L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 pack in 1 L water |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | 2 mg/mL in L-15 |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining solutions | |||
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | PH 7.3 |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% in PBS |
| Triton X-100 | Amresco | ZS-0694 | 0.3% in PBS |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | 10000C | 10% in PBS |
| prestin antibody | Santa Cruz | SC-22694 | dil 1:200 |
| Alexa Fluor 488-conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | dil 1:600 |
| Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | dil 1:200 |
| DAPI | Solarbio | C0060 | dil 1:20 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Extracellular solution | |||
| Leiboviz's L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 pack in 1 L water |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intracellular solution | |||
| CsCl | Sigma | 7647-17-8 | 140 mM |
| MgCl2 | Sigma | 7791-18-6 | 2 mM |
| EGTA | Sigma | 67-42-5 | 10 mM |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Osmometer | Gonotec | OSMOMAT 3000 basic | |
| Forcep | WPI | 14095 | Tweezers dumont |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | MODLE-P97 | |
| Micro Forge | Narishigen | MF-830 | |
| Mini Operating System | Sutter Instrument | MP-285 | |
| MultiClamp | Axon | 700B | |
| Low-Noise Data Acquisition System | Axon | 1440A | |
| ES1 speaker | Tucker-Davis Technologies | ||
| TDT system 3 | Tucker-Davis Technologies | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| SigGenRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| BioSigRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| jClamp | Scientific Solutions | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal | |||
| SD rat | Experimental Animal Center of Southern Medical University |
References
- He, D. Z., Zheng, J., Kalinec, F., Sacchi Kakehata, S. S. a. n. t. o. s. -., J, Tuning in to the amazing outer hair cell: membrane wizardry with a twist and shout. J Membr Biol. 209, 119-134 (2006).
- Dallos, P. Cochlear amplification, outer hair cells and prestin. Curr Opin Neurobiol. 18, 370-376 (2008).
- Zheng, J., et al. Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells. Nature. 405, 149-155 (2000).
- Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
- Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells. J Neurosci. 27, 13890-13902 (2007).
- Zhang, L. I., Bao, S., Merzenich, M. M. Persistent and specific influences of early acoustic environments on primary auditory cortex. Nat Neurosci. 4, 1123 (2001).
- De, V. -. S. E., Chang, E. F., Bao, S., Merzenich, M. M. Critical period window for spectral tuning defined in the primary auditory cortex (A1) in the rat. J Neurosci. 27, 180-189 (2007).
- He, D. Z., Evans, B. N., Dallos, P. First appearance and development of electromotility in neonatal gerbil outer hair cells. Hearing Res. 78, 77-90 (1994).
- Hang, J., et al. Synchronized Progression of Prestin Expression and Auditory Brainstem Response during Postnatal Development in Rats. Neural Plast. , 4545826 (2016).
- Ehret, G. Development of absolute auditory thresholds in the house mouse (Mus musculus). J Am Audiol Soc. 1, 179-184 (1976).
- Møller, A. R. . Hearing:anatomy, physiology, and disorders of the auditory system. , (2006).
- He, D. Z., Zheng, J., Edge, R., Dallos, P. Isolation of cochlear inner hair cells. Hearing Res. 145, 156-160 (2000).
- Tang, J., Pecka, J. L., Tan, X., Beisel, K. W., He, D. Z. Z. Engineered Pendrin Protein, an Anion Transporter and Molecular Motor. J Biological Chem. 286, 31014-31021 (2011).
- Fu, M., et al. The Effects of Urethane on Rat Outer Hair Cells. Neural Plast. 2016, 1-11 (2016).
