Médicaments à base d’anticorps ont révolutionné le traitement de maladies inflammatoires. En plus d’avoir des effets directs sur des cibles spécifiques, les anticorps peuvent activent les macrophages pour devenir anti-inflammatoires. Ce protocole décrit comment anti-inflammatoires macrophage activation peut être évaluée in vitro, à l’aide des macrophages de la moelle osseuse de souris et in vivo, à l’aide des macrophages péritonéaux.
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Article de méthode
Évaluation des effets de médicaments à base d’anticorps murins de la moelle osseuse et d’Activation des macrophages péritonéaux
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les macrophages sont phagocytaires cellules immunitaires innées, initier des réponses immunitaires aux agents pathogènes et de contribuer à la restitution de guérison et de tissus. Les macrophages sont tout aussi importants en éteignant les réponses inflammatoires. Nous avons montré que les macrophages stimulés par des immunoglobulines intraveineuses (IgIV) peuvent produire des quantités élevées de la cytokine anti-inflammatoire, interleukine 10 (IL-10) et de faibles niveaux de cytokines pro-inflammatoires en réponse aux lipopolysaccharides bactériens) LPS). IVIg est qu'un anticorps polyvalent, principalement des immunoglobulines Gs (IgG), mis en commun par le plasma de plus de 1 000 donneurs de sang. Il est utilisé en complément des anticorps chez les patients atteints d’une déficience immunitaire ou pour supprimer les réponses immunitaires chez les patients atteints de maladies auto-immunes ou inflammatoires. Infliximab, un anticorps thérapeutique anti-tumorale nécrose facteur alpha (TNFα) a aussi démontré qu’activent les macrophages pour produire l’IL-10 en réponse à des stimuli inflammatoires. IgIV et autres des produits biologiques à base d’anticorps peuvent être testés afin de déterminer leurs effets sur l’activation des macrophages. Cet article décrit des méthodes pour la dérivation, la stimulation et évaluation de la moelle épinière murine macrophages activés par l’anticorps in vitro et des macrophages péritonéaux murines activés avec anticorps in vivo. Enfin, nous montrent l’utilisation de western blot pour déterminer la contribution de cellule spécifique à l’activité des macrophages anti-inflammatoire des voies de signalisation. Ces protocoles peuvent être associés à des souris génétiquement modifiées, afin de déterminer l’effet d’une ou des protéines spécifiques sur l’activation des macrophages anti-inflammatoires. Ces techniques peuvent également servir à déterminer si les produits biologiques spécifiques peuvent agir en changeant les macrophages à un état d’activation anti-inflammatoires productrices de IL-10 qui réduit les réactions inflammatoires in vivo. Cela peut fournir des informations sur le rôle de l’activation de macrophages dans l’efficacité des produits biologiques au cours de modèles de maladies chez les souris et donnent un aperçu d’un nouveau mécanisme de potentiel d’action chez les personnes. À l’inverse, cela peut mettre en garde contre l’utilisationdes spécifiques produits biologiques à base d’anticorps pour traiter les maladies infectieuses, surtout si les macrophages jouent un rôle important dans la défense de l’hôte contre l’infection.
Introduction
Les macrophages sont des cellules immunitaires innées, qui jouent des rôles multiples dans la réponse immunitaire à l’infection ou de lésion. Les macrophages sont responsables d’initier une réponse immunitaire à l’infection ou un tissu de dommages, arrêt la réponse inflammatoire et favoriser la guérison de la réponse1. On peut citer les trois États d’activation mieux étudiés macrophage : 1) macrophages traités par l’interféron gamma (IFNγ) et bactérien lipopolysaccharide (LPS), désigné M (IFNγ + LPS), qui contribuent à la réponse inflammatoire ; 2) macrophages stimulés par l’interleukine 4 (IL-4), M(IL-4), qui sont associés à la réponse de guér....
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Protocole
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université de la Colombie-Britannique.
1. moelle osseuse Macrophage dérivation et Activation avec des anticorps
- Effectuer à l’aide de CO2 asphyxie l’euthanasie.
- Souris de place dans la chambre de l’induction. Euthanasier la souris avec l’anesthésie isoflurane 5 %, pour les 60-90 s, jusqu'à ce qu’immobile et respiration sont lente et profonde.
- Désactiver l’anesthésie isoflurane et administrer les 6-8 L/min de CO2 jusqu'à ce que la souris a cessé de respirer. Laisser souris....
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Résultats
Macrophages dérivé de moelle osseuse murine peuvent être cultivées à partir de précurseurs de cellules hématopoïétiques dans la ponction de moelle osseuse. Ponction de moelle osseuse regroupées à partir de fémurs et tibias de souris C57BL/6 en général donne 10 macrophages de la moelle osseuse provenant de7 , rendant une source commode de macrophages pour les expériences. BMDMs peuvent être utilisés pour tester la base drogue d’anticorps lorsque confrontés à un stimulus inflamma.......
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Discussion
États d’activation de macrophages jouent un rôle important dans les deux tissus l’homéostasie et maladie22. Les macrophages peuvent avoir distinctes ainsi que la superposition des États d’activation, selon repères dans leur microenvironnement3. Ils ont des rôles distincts dans toutes les étapes de la réponse inflammatoire : la défense contre les agents pathogènes, restitution de tissus et de guérison de blessure et ont aussi un état d’activation anti-inflammatoires distinct.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.
Remerciements
L.K. est le lauréat de l’Université de la Colombie-Britannique 4 ans (4YF) bourse d’études supérieures bourse. L.M.S. bénéficie d’une Association canadienne de gastro-entérologie / maladie de Crohn et la colite Canada / nouveau salaire de chercheur des IRSC Award et est un chercheur biomédical de la Michael Smith Foundation for Health Research. Ce travail a été soutenu par une subvention de projet de la société canadienne du sang, en collaboration avec les instituts de recherche en santé (# CIHR2016-LS de subventions).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Iscove' s modifié Dulbecco' s medium (IMDM) | Life technologies | 12440053 | |
| Fetal Bovin Serum (FBS) | Life technologies | 12483-020 | |
| Facteur de stimulation des colonies de macrophages murins recombinants (MCSF) | Stemcell technologies | 78059 | |
| Pénicilline-streptomycine | Life technologies | 15140148 | |
| Monothioglycérol (MTG) | Sigma | 88640 | |
| 1X tampon de lyse des globules rouges | eBioscience | ||
| Tampon de dissociation cellulaire | Technologies de la vie | 13150016 | Sans enzymes, à base de Hanks, |
| Lipopolysaccharide EDTA (LPS) | Sigma aldrich | L 4516 | D’E. coli 0127 :B8 |
| IVIg (Gammunex) | Grifols | Reçu de l’Hôpital pour enfants de la Colombie-Britannique, Médecine transfusionnelle | |
| IgIV (Gammagard liquide) | Baxter Healthcare Corporation | Reçu de l’Hôpital pour enfants de la Colombie-Britannique, Médecine transfusionnelle IgIV | |
| (Octagam) | Octapharma | Reçu de l’Hôpital pour enfants de la Colombie-Britannique, Médecine | |
| Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (stérile), pH 7,4 | de vie | 10010023 | |
| souris IL-10 ELISA | BD biosciences | 555252 | |
| souris IL-12/23p40 ELISA | BD biosciences | 555165 | |
| anticorps anti-Erk1/2 | Technologie de signalisation cellulaire | 9101 | |
| anticorps anti-pp38 | Technologie de signalisation cellulaire | 9211 | |
| anticorps anti-GAPDH | Fitzgerald industries | 10R-G109A | |
| Aiguille 26 g | BD biosciences | 305110 | |
| Seringue de 1 mL | BD biosciences | 309659 | |
| Seringue de 10 mL | BD biosciences | 309604 | |
| tube conique de 15 mL | BD biosciences | 352096 | |
| tube conique de 50 mL | de BD biosciences | 352070 | |
| tube de microcentrifugation (1,7 mL) | Diamed | SPE155-N | |
| 75 cm2 flacon traité pour culture tissulaire | BD biosciences | 353136 | |
| Racleur cellulaire | BD biosciences | 353085 | |
| Forcepts | VWR | 82027-386 | pointe fine, dissection. |
| Ciseaux | VWR | 82027-582 | Délicat, 4 1/2" |
| Microscope à fond clair | Motic | AE31 | Échelle de contraste de phase inversé |
| ; | Mettler ; | PE 3000 |
Références
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).
- Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13(201....
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Réimpressions et autorisations
