كشف حساسة للغاية وكمية من البروتينات وعلى إيسوفورمس بطريقة تركز Isoelectric الشعرية
Summary
تركز isoelectric الشعرية أسلوب المستندة إلى جسم، أولتراسينسيتيفي، وارتفاع إنتاجية، مما يتيح وصف مفصل للبروتينات وما إيسوفورمس من عينات بيولوجية ضئيلة للغاية. فيما يلي وصف لوضع بروتوكول للكشف والتحديد الكمي لبروتينات محددة وعلى إيسوفورمس بطريقة تلقائية و robotized.
Abstract
وقد أصبح Immunoblotting تقنية روتينية في العديد من المختبرات لتوصيف البروتين من العينات البيولوجية. ويوفر البروتوكول التالي استراتيجية بديلة، الشعرية isoelectric التركيز (سيف)، مع العديد من المزايا بالمقارنة مع إيمونوبلوتينج التقليدية. هذا هو أسلوب القائم على جسم الآلي والسريع، والكمية التي إجراء blotting غربية كاملة تجري داخل الشعرية سامسونج. هذا الأسلوب لا يتطلب هلام لنقل إلى غشاء، تجريد من البقع، أو الأشعة السينية الأفلام، الذي يشترط عادة ل immunoblotting التقليدية. وهنا يتم فصل البروتينات وفقا للتهمة (isoelectric نقطة؛ pI)، استخدام أقل من ميكروليتير (400 nL) من مجموع البروتين ليستي. بعد التفريد، البروتينات هي معطلة على جدران الشعيرات الدموية بالأشعة فوق البنفسجية العلاج الخفيفة، تليها الابتدائية والثانوية (الفجل البيروكسيديز (HRP) مترافق) حضانة الأجسام المضادة، يتم الكشف عن الذين ملزمة من خلال تعزيز تشيميلومينيسسينسي (الممنوعين)، توليد إشارة خفيفة يمكن التقاطها وتسجيلها بكاميرا جهاز اقتران (CCD). الصور الرقمية يمكن تحليلها وقياسها كمياً (منطقة الذروة) باستخدام البرمجيات. يمكن التعامل مع هذا الإجراء إنتاجية عالية 96 عينة في وقت واحد؛ هي حساسة للغاية، مع الكشف عن البروتين في مجموعة حلول؛ وتنتج النتائج استنساخه بدرجة عالية بسبب التشغيل الآلي للمكاتب. كل هذه الجوانب قيمة للغاية عندما تكون كمية العينات (مثلعينات الأنسجة والخزعات) عاملاً مقيداً. التقنية بالتطبيقات الأوسع نطاقا، بما في ذلك فحص للمخدرات أو الأجسام المضادة، واكتشاف العلامات البيولوجية، وأغراض التشخيص.
Introduction
تركز isoelectric الشعرية (سيف) هو المناعة التلقائية المستندة إلى الشعرية، الذي يحل البروتينات على أساس هذه التهمة1،2،3. أنها استنساخه للغاية وقادرة على حل البروتينات و isoforms بوستترانسلاتيونالي المعدلة سرعة كما وكيفا. وهو يقدم بديلاً للأساليب التقليدية مثل النشاف الغربية. وفي حين النشاف الغربية جيدة جداً لتأكيد وجود وفرة من البروتينات في عينات متاحة؛ تقلب واستهلاك الوقت وجميع الحاضرين دقيقة كوانتيتيشن تحديات، ولا سيما عند فحص عينات الأنسجة البيولوجية. في الواقع، تقلب مشكلة متأصلة في النشاف الغربية، كما أن هناك العديد من الخطوات المعنية، مثل تحميل وتشغيل من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة المواد الهلامية، ونقل البروتينات إلى غشاء، حضانة مع الكواشف المختلفة (على سبيل المثال. والابتدائي والثانوي الأجسام المضادة، القامة)، والتنمية على الأشعة السينية الفيلم4. في الوقت الحاضر، هو تحسين تقنية blotting الغربية بتنفيذ التسجيل الرقمي للإشارات تشيميلومينيسسينت (الغرب الرقمية). في الآونة الأخيرة، نظام blotting غربية قد وضعت، إلا وهي شعري الغربي، ونظام أكثر خالية اليدين وخالية من جل. فحص كامل آليا بعد تحميل لوحة عينة (عينات مع جميع الكواشف اللازمة) إلى3،نظام4. الصك الذي سيتم تنفيذ كافة الخطوات مثل فصل البروتين، يغسل التثبيت بروتينات على الجدار الشعرية، والأجسام المضادة إينكوبيشنز، بين الخطوات المختلفة، والتنمية، والتقدير الكمي للإشارات تشيميلومينيسسينت. وهكذا، يوفر الإجراء سيف الذي قدم هنا أعلى من القرار وحساسية.
هذا الأسلوب الحساسة، كما يمكن إنشاء إشارات وكمية من بيكوغرامات من البروتينات1. حساسية عالية مع إمكانية تكرار نتائج ممتازة يجعل هذه التكنولوجيا مفيدة للغاية لتحليل العينات السريرية. يمكن الكشف عن فضلا عن التمييز بين وظيفة التعديل متعدية الجنسيات (مثلاً، isoforms مختلفة من البروتين فوسفوريلاتيد) من البروتينات. هذه التكنولوجيا قد استخدمت بنجاح لتشريح مختلفة مما يشير إلى مسارات4،5 في الدراسات السريرية التي تهدف إلى تطوير علاجات جديدة في سرطان3، وأنه يتمتع بإمكانات كبيرة لاكتشاف العلامات البيولوجية والمخدرات البروتين .
Protocol
Representative Results
Discussion
حساسية والقرار من البروتينات ذات أهمية حاسمة لبحوث البروتين في عينات بيولوجية. هناك قيمة كبيرة في كونه قادراً على الكشف عن البروتينات التي موجودة بكميات دقيقة في الخلايا. يمكن أن نقدم سيف تحسين حساسية والقرار للكشف عن البروتينات وعلى إيسوفورمس4.
هذه التكنولوج?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
صاحب البلاغ وذلك بفضل الأستاذ لينا كلايسون-الويلزية، جامعة أوبسالا، السويد عن تأييدها لتطوير هذا المشروع. بالإضافة إلى ذلك، فضل صاحب البلاغ روس سميث ولينا كلايسون-الويلزية، جامعة أوبسالا لقراءة نقدية واقتراحات لتحسين هذه المخطوطة.
Materials
| NanoPro 1000 | ProteinSimple | ||
| Premix G2, pH 5–8 (nested) separation gradient, pH 2–4 plug | ProteinSimple | 040-972 | Ampholyte premix |
| DMSO inhibitor mix | ProteinSimple | 040-510 | Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used |
| Aqueous Inhibitor Mix | ProteinSimple | 040-482 | Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used |
| pI standard ladder 3 | ProteinSimple | 040-646 | For cIEF 1:60 dilution used |
| Sample diluent | ProteinSimple | 040-649 | |
| Antibody diluent | ProteinSimple | 040-309 | |
| Wash concentrate | ProteinSimple | 041-108 | |
| Anolyte Refill | ProteinSimple | 040-337 | |
| Catholyte Refill | ProteinSimple | 040-338 | |
| Peroxide XDR | ProteinSimple | 041-084 | |
| Luminol | ProteinSimple | 040-652 | |
| Bicine/CHAPS Lysis Buffer | ProteinSimple | 040-764 | |
| Capillaries-Charge Separation (1 pack) for | ProteinSimple | CBS700 | |
| Assay Plate/Lid Kit | ProteinSimple | 040-663 | |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | For cIEF used (1: 300) |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For cIEF used (1: 300) |
| Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody | Cell Signaling | 9101 | For cIEF used (1: 50) |
| Pan Erk Primary Antibody | Cell Signaling | 9102 | For cIEF used (1: 100) |
| Compass software | ProteinSimple | ||
| HUVEC | ATCC | PCS-100-010 | |
| MV2 (EBM-2) | PromoCell | C-22221 | Endothelia cell basal medium |
| Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack | PromoCell | C-39221 | Supplementation to MV2 above |
| VEGFA | PeproTech | 100-20 | |
| Long R3 IGF | Sigma-Aldrich | 85580C/I1146 | Insulin-like growth factor |
| Bioruptor (Sonicator) | Diagenode | B01020001 | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Fischer Scientific | 23225 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fischer Scientific | NP0322BOX | |
| NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0001 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0006 | |
| Immobilon PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Microfuge tube vortexer | |||
| Centrifuge | |||
| Microtiter plate adapter for centrifuge | |||
| Pipettors | |||
| Tips | |||
| Ice |
References
- O’Neill, R. A., et al. Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).
- Aspinall-O’Dea, M., et al. Antibody-based detection of protein phosphorylation status to track the efficacy of novel therapies using nanogram protein quantities from stem cells and cell lines. Nat Protoc. 10 (1), 149-168 (2015).
- Fan, A. C., et al. Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens. Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).
- Padhan, N., et al. High sensitivity isoelectric focusing to establish a signaling biomarker for the diagnosis of human colorectal cancer. BMC Cancer. 16 (1), 683 (2016).
- Sun, Z., et al. VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd. J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).
- Iacovides, D. C., et al. Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay. Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Unger, F. T., et al. Nanoproteomic analysis of ischemia-dependent changes in signaling protein phosphorylation in colorectal normal and cancer tissue. J Transl Med. 14, 6 (2016).
- Urasaki, Y., Pizzorno, G., Le, T. T. Chronic uridine administration induces fatty liver and pre-diabetic conditions in mice. PLoS One. 11 (1), e0146994 (2016).
- Schmidt, L., et al. Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene. Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).
