Mycket känslig och kvantitativa påvisande av proteiner och deras isoformer av kapillär isoelektrisk fokusering metod
Summary
Kapillär isoelektrisk fokusering är en antikroppsbaserade, ultrasensitive, hög genomströmning teknik, möjliggör detaljerad karakterisering av proteiner och deras isoformer från extremt små biologiska prover. Nedan beskrivs ett protokoll för detektion och kvantifiering av specifika proteiner och deras isoformer på ett automatiserat och robotiserade sätt.
Abstract
Immunoblotting har blivit en rutin teknik i många laboratorier för protein karakterisering från biologiska prover. Följande protokoll ger en alternativ strategi, kapillär isoelektrisk fokusering (cIEF), med många fördelar jämfört med konventionella immunoblotting. Detta är en antikroppsbaserade, automatisk, snabb och kvantitativa metod där ett komplett western blotting förfarande äger rum inuti en ultrathin kapillär. Denna teknik inte kräver en gel att överföra till ett membran, strippning av blotting, eller Röntga filmar, som vanligtvis krävs för konventionella immunoblotting. Här, proteiner är separerade enligt sin laddning (isoelektrisk punkt, pI), med mindre än en mikroliter (400 nL) av totalt protein lysate. Efter elektrofores, proteiner är orörlig på kapillär väggarna av ultraviolett ljus behandling, följt av primära och sekundära (pepparrotsperoxidas (HRP) konjugerade) antikropp inkubation, vars bindande upptäcks genom förbättrad chemiluminescence (ECL), genererar en ljussignal som kan fångas och inspelad av en avgift – tillsammans enhet (CCD) kamera. Den digitala bilden kan analyseras och kvantifieras (topparea) med hjälp av programvara. Proceduren hög genomströmning kan hantera 96 prover på en gång; är mycket känslig, med protein upptäckt i intervallet pikogram; och producerar mycket reproducerbara resultat på grund av automatisering. Alla dessa aspekter är ytterst värdefulla när kvantiteten av prover (t.ex., vävnadsprover och biopsier) är en begränsande faktor. Tekniken har bredare program, inklusive screening för droger eller antikroppar, biomarkör identifiering och diagnostiska ändamål.
Introduction
Kapillär isoelektrisk fokusering (cIEF) är en automatiserad, kapillär-baserad immunoassay som löser proteiner på grundval av deras avgift1,2,3. Det är mycket reproducerbara och kan lösa proteiner och deras post-translationally modifierade isoformer snabbt och kvantitativt. Den presenterar ett alternativ till konventionella metoder såsom western blotting. Även western blotting är mycket bra för att bekräfta förekomsten av rikliga proteiner i lättillgängliga prover; variabilitet, tidsförbrukning och noggrann kvantitering alla närvarande utmaningar, i synnerhet när man undersöker biologiska vävnadsprover. Indeed, variabilitet är ett inneboende problem i western blotting, så finns det flera steg inblandade, såsom lastning och körning av SDS-PAGE geler, överföring av proteiner på membran, inkubation med olika reagens (t.ex., primära och sekundära antikroppar, ECL), och utvecklingen på röntgen film4. För närvarande, förbättras western blotting tekniken med genomförandet av digital inspelning av Kemiluminiscens signaler (digitala västernfilmer). Nyligen, ett automatiserat western blotting system har utvecklats, nämligen kapillären västra, som är ett handsfree- och gel-fria system. Hela analysen är automatiserad efter inläsningen av en prov tallrik (prover med alla nödvändiga reagens) i system3,4. Instrumentet kommer att utföra alla steg såsom protein separation, immobilisering av proteiner på kapillär vägg, antikropp inkubationer, tvättar mellan olika steg, och utveckling och kvantifiering av Kemiluminiscens signalerna. CIEF proceduren presenteras här ger således högre upplösning och känslighet.
Denna metod är känslig, som signaler kan genereras och kvantifieras från pikogram proteiner1. Hög känslighet med utmärkt reproducerbarhet gör denna teknik mycket användbar för analys av kliniska prover. Det kan upptäcka samt skilja post translationell modifiering (t.ex. olika fosforyleras protein isoformer) av proteiner. Denna teknik har använts framgångsrikt att dissekera olika signalering vägar4,5 i kliniska studier som syftar till att utveckla nya therapeutics i cancer3, och det har stor potential för protein biomarkör och drug discovery .
Protocol
Representative Results
Discussion
Känslighet och upplösning av proteiner är avgörande för proteomiska forskning om biologiska prover. Det är stort värde i att kunna identifiera proteiner som finns i minuten mängder i celler. cIEF kan erbjuda förbättrad känslighet och upplösning för påvisande av proteiner och deras isoformer4.
Denna teknik har använts framgångsrikt i många proteomiska forskning rapporter5,6,<sup class=…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författaren tack Prof. Lena Claesson-Welsh, Uppsala universitet för hennes stöd för att utveckla detta projekt. Dessutom tack författaren Ross Smith och Lena Claesson-Welsh, Uppsala universitet för deras kritisk läsning och förslag för att förbättra manuskriptet.
Materials
| NanoPro 1000 | ProteinSimple | ||
| Premix G2, pH 5–8 (nested) separation gradient, pH 2–4 plug | ProteinSimple | 040-972 | Ampholyte premix |
| DMSO inhibitor mix | ProteinSimple | 040-510 | Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used |
| Aqueous Inhibitor Mix | ProteinSimple | 040-482 | Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used |
| pI standard ladder 3 | ProteinSimple | 040-646 | For cIEF 1:60 dilution used |
| Sample diluent | ProteinSimple | 040-649 | |
| Antibody diluent | ProteinSimple | 040-309 | |
| Wash concentrate | ProteinSimple | 041-108 | |
| Anolyte Refill | ProteinSimple | 040-337 | |
| Catholyte Refill | ProteinSimple | 040-338 | |
| Peroxide XDR | ProteinSimple | 041-084 | |
| Luminol | ProteinSimple | 040-652 | |
| Bicine/CHAPS Lysis Buffer | ProteinSimple | 040-764 | |
| Capillaries-Charge Separation (1 pack) for | ProteinSimple | CBS700 | |
| Assay Plate/Lid Kit | ProteinSimple | 040-663 | |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | For cIEF used (1: 300) |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For cIEF used (1: 300) |
| Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody | Cell Signaling | 9101 | For cIEF used (1: 50) |
| Pan Erk Primary Antibody | Cell Signaling | 9102 | For cIEF used (1: 100) |
| Compass software | ProteinSimple | ||
| HUVEC | ATCC | PCS-100-010 | |
| MV2 (EBM-2) | PromoCell | C-22221 | Endothelia cell basal medium |
| Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack | PromoCell | C-39221 | Supplementation to MV2 above |
| VEGFA | PeproTech | 100-20 | |
| Long R3 IGF | Sigma-Aldrich | 85580C/I1146 | Insulin-like growth factor |
| Bioruptor (Sonicator) | Diagenode | B01020001 | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Fischer Scientific | 23225 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fischer Scientific | NP0322BOX | |
| NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0001 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0006 | |
| Immobilon PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Microfuge tube vortexer | |||
| Centrifuge | |||
| Microtiter plate adapter for centrifuge | |||
| Pipettors | |||
| Tips | |||
| Ice |
References
- O’Neill, R. A., et al. Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).
- Aspinall-O’Dea, M., et al. Antibody-based detection of protein phosphorylation status to track the efficacy of novel therapies using nanogram protein quantities from stem cells and cell lines. Nat Protoc. 10 (1), 149-168 (2015).
- Fan, A. C., et al. Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens. Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).
- Padhan, N., et al. High sensitivity isoelectric focusing to establish a signaling biomarker for the diagnosis of human colorectal cancer. BMC Cancer. 16 (1), 683 (2016).
- Sun, Z., et al. VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd. J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).
- Iacovides, D. C., et al. Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay. Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Unger, F. T., et al. Nanoproteomic analysis of ischemia-dependent changes in signaling protein phosphorylation in colorectal normal and cancer tissue. J Transl Med. 14, 6 (2016).
- Urasaki, Y., Pizzorno, G., Le, T. T. Chronic uridine administration induces fatty liver and pre-diabetic conditions in mice. PLoS One. 11 (1), e0146994 (2016).
- Schmidt, L., et al. Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene. Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).
