באמצעות קרינה פלואורסצנטית בחיי עיר הכלאה (דגים) כדי לנטר את מצב היד לכידות ב- Prometaphase, מפה של אני דרוזופילה Oocytes
Summary
כתב יד זה מציג שיטה מפורטת ליצירת X-כרומוזום הזרוע המחקרים וכל ביצוע קרינה פלואורסצנטית בחיי עיר הכלאה (דגים) לבדוק את מצבה של אחותך כרומטידה לכידות ב- prometaphase, מפה של עצרתי דרוזופילה oocytes. פרוטוקול זה מתאים לקביעת אם הזרוע meiotic לכידות הוא שלם או קטועים ב שונים אחרים.
Abstract
בבני אדם, כרומוזום סגרגציה שגיאות oocytes אחראים המכריע של הפלות, מומים מולדים. יתר על כן, נשים בגיל, הסיכון שלהם להריון שהעובר aneuploid גדל באופן דרמטי, תופעה זו נקראת השפעת גיל אימהי. אחד הדרישה כרומוזום מדויק סגרגציה במהלך לחטיבות meiotic הוא תחזוקה של אחותו כרומטידה לכידות במהלך התקופה המורחבת prophase oocytes להיתקל. ממצאים cytological בני אדם והן דגם אורגניזמים מעידים כי לכידות meiotic מתדרדר במהלך תהליך ההזדקנות. בנוסף, הפרדה בין שגיאות oocytes האנושי הם הנפוצות ביותר במהלך המיוזה אני, עקבי עם הפסד מוקדמת של הזרוע לכידות. השימוש של אורגניזמים מודל הוא קריטי עבור להתיר את המנגנונים העומדים בבסיס תלויי-גיל אובדן של לכידות. דרוזופילה melanogaster מציע מספר יתרונות לימוד ברגולציה של לכידות meiotic ב oocytes. עם זאת, עד לאחרונה, רק בדיקות גנטיות היו זמינות assay אובדן היד לכידות ב oocytes של אחרים שונים או בתנאים שונים ניסיוני. כאן, הוא פרוטוקול מפורט בתנאי לשימוש פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה (דגים) ישירות להמחיש מפגמים הזרוע לכידות ב prometaphase מפה של עצרתי דרוזופילה oocytes ואני. על ידי יצירת בדיקה דגים זה hybridizes את הזרוע דיסטלי של כרומוזום ה- X ואיסוף קונאפוקלית ערימות Z, חוקר יכול להמחיש את מספר אותות נפרדים דגים בשלושה ממדים ו לקבוע אם אחותי כרומטידה הזרועות מופרדים. ההליך שתואר מאפשר לכמת פגמים לכידות הזרוע מאות דרוזופילה oocytes. ככזה, בשיטה זו מספק כלי חשוב לחקור את המנגנונים שתורמים לכידות תחזוקה, כמו גם את הגורמים שמובילים את מותו במהלך תהליך ההזדקנות.
Introduction
סגרגציה תקין של הכרומוזומים במהלך מיטוזה, מיוזה דורש האחות כרומטידה לכידות להיות הוקמה, ומתוחזק שפורסם אופנה מתואמת1,2. לכידות נוסדה במהלך שלב S ומתווך על ידי cohesin מורכבים, המהווה קישורים פיזיים להחזיק את האחות chromatids ביחד. מיוזה, לכידות דיסטלי להתהפכויות גם מתפקד להחזיק homologs רקומביננטי יחד, הקשר גופניות הזה מסייע להבטיח כיוון נכון של טרינארית על כל ציר אני (איור 1)3,4, 5. שחרורו של הזרוע לכידות-“אנאפאזה” אני מאפשר את homologs הפרדת כדי צירים ההפוכים. עם זאת, אם הזרוע לכידות פגים, homologs רקומביננטי לאבד את החיבור הפיזי שלהם גם של הפרדת באופן אקראי, אשר יכול לגרום aneuploid לגמטות (איור 1).
ב- oocytes האנושי, שגיאות בסגרגציה כרומוזום הגורם המוביל של הפלות, מומים מולדים, כגון תסמונת דאון6, השכיחות שלהם עולה אקספוננציאלית עם גיל7. כרומטידה אחות לכידות נוסדה בשנת oocytes עוברי, רקומבינציה meiotic הושלמה לפני הלידה. Oocytes ואז לעצור באמצע prophase אני עד הביוץ ובמהלך המעצר הזה, האגודה פיזי מתמשך של homologs רקומביננטי מסתמך על אחותי כרומטידה לכידות. לכן, הפרדה מדויקת במהלך המיוזה ותוצאות הריון נורמלי דורשים כי לכידות נשארים בעינם עד חמישה עשורים.
אובדן מוקדמת של לכידות במהלך מעצרו meiotic ממושך של האדם oocytes הוצע לתרום האפקט גיל אימהי, שורות מרובות של ראיות תומכות זו השערה8,9. עם זאת, לאור האתגרים של הלומדים לכידות meiotic ב oocytes האנושי, הרבה ההבנה שלנו של תופעה זו מסתמך על השימוש של מודל אורגניזמים5,10,11,12, 1314,,15.
דרוזופילה melanogaster oocytes מציעים יתרונות רבים עבור המחקר של סגרגציה לכידות והסכמה כרומוזום meiotic. Assay הגנטי פשוטות מאפשרת לשחזר רומא גמטות aneuploid ולמדוד את הנאמנות של X-הפרדה בין כרומוזום16,11,17בקנה מידה גדול. יתר על כן, אחד יכול גם לקבוע האם כרומוזום סגרגציה שגיאות מתעוררות כי homologs רקומביננטי missegregate במהלך המיוזה אני, הפנוטיפ עקבי עם אובדן היד לכידות11,18, מוקדמת 19. ישיר התבוננות המדינה של לכידות meiotic ב דרוזופילה oocytes אפשרי גם באמצעות קרינה פלואורסצנטית בחיי עיר הכלאה (דגים). למרות oligonucleotides פלורסנט כי hybridize אל לווין חוזרות רצפים שימשו במשך יותר מעשור כדי לפקח על לכידות pericentromeric בוגרת דרוזופילה oocytes4,20, ניתוח של הזרוע לכידות כבר הרבה יותר מאתגר. ויזואליזציה של מצב היד לכידות דורש בדיקה המתפרס על אזור גדול של עותק בודד רצף בהיר מספיק את התוצאה גלוי אותות עבור אחותי בודדים chromatids כאשר היד לכידות נעדר. בנוסף, התנאים קיבוע oocyte והגודל של DNAs שכותרתו חייבת לאפשר חדירה21 לתוך גדול בוגר דרוזופילה oocyte (200 מיקרומטר רחב על ידי רב 500 מיקרומטר). לאחרונה, בדיקה הזרוע היה בהצלחה מנוצל כדי להמחיש דרוזופילה oocyte chromatids במהלך “אנאפאזה”, אבל המחברים הצהיר כי הם לא היתה אפשרות לזהות אות ב- prometaphase או מפה של עצרתי oocytes22. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור הדור של X-זרוע כרומוזום דגים רגשים ועל תנאים הכנה oocyte אפשרו לנו assay לירידה מוקדמת של אחותו כרומטידה לכידות ב- prometaphase ומפה של אני oocytes. שיטות אלה, אשר אפשרו לנו לזהות מוצרים גנים הדרושים לשם שמירה על לכידות meiotic, יאפשר לאחרים assay עבור אחותי כרומטידה לכידות מפגמים בוגרת דרוזופילה oocytes של אחרים שונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
השימוש של דגים רגשים להעריך מצב היד לכידות ב prometaphase אני מפה של אני דרוזופילה oocytes הוא קידום משמעותי בשדה של מיוזה דרוזופילה . מבחינה היסטורית, חוקרים דרוזופילה היה מוגבל ל בדיקות גנטיות להסיק מוקדמת אובדן היד לכידות בוגרת oocytes11,18,<sup class="xr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH גרנט GM59354 מוענק שרון אי ביקל. אנו מודים הוי נגוין ש לקבלת סיוע בפיתוח הפרוטוקול ליצירת זרוע פלורסנט הגששים, אן Lavanway לעזרה עם מיקרוסקופיה קונפוקלית ולאחר ג’ ריד אמיליאנו לקבלת סיוע טכני. אנו מודים גם יחד עם עמיתים רבים בקהילה דרוזופילה עבור דיונים מועילים ועצות.
Materials
| Kits | |||
| Midi Prep kit | Qiagen | 12143 | Prep BAC clone DNA |
| GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit | Sigma | WGA2 | Amplify BAC clone DNA |
| ARES Alexa Fluor 647 DNA labeling kit | Invitrogen | A21676 | Label BAC clone DNA |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Remove non-conjugated dye following labeling of BAC clone DNA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals & Solutions | |||
| Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization. | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | Prepare 10% stock Freeze aliquots |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C75-500 | |
| DAPI (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | Toxic: wear appropriate protection. Prepare 100µg/ml stock in 100% ethanol, store in aliquots at -20 °C. Prepare 1 µg/ml solution in 2X SSCT before use. |
| Dextran sulfate | Sigma | D-8906 | |
| Drierite | Drierite Company | 23001 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Invitrogen | 15508-013 | Prepare 10 mM stock |
| dTTP (10 µmol, 100 µl) | Boehringer Mannheim | 1277049 | Prepare 1 mM stock |
| EDTA (Disodium ethylenediamine tetraacetic acid) | Fisher Scientific | S311-500 | Prepare 250 mM stock |
| 100% ethanol (molecular grade, 200 proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
| Tris (Ultra Pure) | Invitrogen | 15504-020 | |
| EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid) | Sigma | E-3889 | |
| 16% formaldehyde | Ted Pella, Inc. | 18505 | Toxic: wear appropriate protection |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | Toxic: wear appropriate protection |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Glycogen | Roche | 901393 | |
| HEPES | Boehringer Mannheim | 737-151 | |
| Heptane | Fisher Scientific | H350-4 | Toxic: wear appropriate protection. |
| Hydrochloric acid | Millipore | HX0603-4 | Toxic: wear appropriate protection. |
| Hydroxylamine | Sigma | 438227 | Prepare 3 M stock |
| 4.9 M Magnesium chloride | Sigma | 104-20 | |
| Na2HPO4 Ÿ 7H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaH2PO4 Ÿ 2H2O | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Poly-L-lysine (0.1mg/ml) | Sigma | P8920-100 | |
| Potassium acetate | Fisher Scientific | BP364-500 | |
| Sodium acetate | Fisher Scientific | S209-500 | Prepare 3M stock |
| Sodium cacodylate | Polysciences, Inc. | 1131 | Toxic: wear appropriate protection. Prepare 400mM stock |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | Sodium chloride |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| 10% Tween 20 | Thermo Scientific | 28320 | Surfact-Amps |
| 10% Triton X-100 | Thermo Scientific | 28314 | Surfact-Amps |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization. | |||
| TE buffer | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8.0 | ||
| 20X SSC (Saline Sodium Citrate) | 3 M NaCl, 300 mM sodium citrate | ||
| 2X cacodylate fix solution | Toxic: wear appropriate protection. 200 mM sodium cacodylate, 200 mM sucrose, 80 mM sodium acetate, 20 mM EGTA | ||
| 1.1X Hybridization buffer | 3.3X SSC, 55% formamide, 11% dextran sulfate | ||
| Fix solution | Toxic: wear appropriate protection. 4% formaldehyde, 1X cacodylate fix solution | ||
| PBSBTx | 1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100 | ||
| PBSTx | 1X PBS, 1% Trition X-100 | ||
| Extraction buffer (PBSTx + Rnase) | 1X PBS, 1% Trition X-100, 100 µg/mL RNase | ||
| 2X SSCT | 2X SSC, 0.1% Tween 20 | ||
| 2X SSCT + 20% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 20% formamide | ||
| 2X SSCT + 40% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 40% formamide | ||
| 2X SSCT + 50% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 50% formamide | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enzymes | |||
| AluI | New England Biolabs | R0137S | |
| HaeIII | New England Biolabs | R0108S | |
| MseI | New England Biolabs | R0525S | |
| MspI | New England Biolabs | R0106S | |
| RsaI | New England Biolabs | R0167S | |
| BfuCI | New England Biolabs | R0636S | |
| 100X BSA | New England Biolabs | Comes with NEB enzymes | |
| 10X NEB buffer #2 | New England Biolabs | Restriction enzyme digestion buffer. Comes with NEB enzymes | |
| Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U/µl | Roche/Sigma | 3333566001 | |
| TdT buffer | Roche/Sigma | Comes with TdT enzyme | |
| Cobalt chloride | Roche/Sigma | Toxic: wear appropriate protection. Comes with TdT enzyme | |
| RNase A (10 mg/mL) | Thermo-Scientific | EN0531 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytology Tools etc. | |||
| Forceps | Dumont | #5 INOX, Biologie | |
| 9” Disposable glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | Autoclave to sterilize |
| Shallow glass dissecting dish | Custom made | ||
| Deep well dish (3 wells) | Pyrex | 7223-34 | |
| Fisherfinest Premium microscope slides | Fisher Scientific | 22-038-104 | Used to cover deep well dishes |
| Frosted glass slides, 25 x 75 mm | VWR Scientific | 48312-002 | |
| Glass slides, 3 x 1 in, 1 mm thick | Thermo-Scientific | 3051 | |
| Coverslips, 10 x 10 mm, No. 1.5 | Thermo-Scientific | 3405 | |
| Tungsten needle | homemade | ||
| Prolong GOLD mounting media | Molecular Probes | P36930 | |
| Compressed-air in can | Various | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR machine | Various | ||
| Nanodrop 2000, spectrophotometer | Thermo-Scientific | microvolume spectrophotometer | |
| Vortexer | Various | ||
| Table top microfuge at room temperature | Various | ||
| Table top microfuge at 4 °C | Various | ||
| Heat block | Various | ||
| Hybridization oven or incubator with rotator | Various | ||
| Nutator | Various | ||
| A1RSi laser scanning confoal | Nikon | 40X oil Plan Fluor DIC (NA 1.3) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables etc. | |||
| 50 mL conical tubes | Various | ||
| 15 mL conical tubes | Various | ||
| 1.5 mL microfuge tubes | Various | ||
| 500 µl microfuge tubes | Various | ||
| 200 µl PCR tubes | Various | ||
| Plastic container with tight fitting lid | Various | To hold Drierite | |
| Kimwipes | Various | disposable wipes | |
| Parafilm | Various | paraffin film | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other | |||
| HPLC purified 5'-labeled oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | Cy3-labeled probes that recognize the 359 bp satellite repeat of the X chromosome | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | PerkinElmer | Version 6.3 |
References
- Peters, J. M., Nishiyama, T. Sister chromatid cohesion. CSH Perspect Biol. 4 (11), (2012).
- McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. Cohesin in gametogenesis. Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).
- Buonomo, S. B., et al. Disjunction of homologous chromosomes in meiosis I depends on proteolytic cleavage of the meiotic cohesin Rec8 by separin. Cell. 103 (3), 387-398 (2000).
- Bickel, S. E., Orr-Weaver, T., Balicky, E. M. The sister-chromatid cohesion protein ORD is required for chiasma maintenance in Drosophila oocytes. Curr. Biol. 12 (11), 925-929 (2002).
- Hodges, C. A., Revenkova, E., Jessberger, R., Hassold, T. J., Hunt, P. A. SMC1beta-deficient female mice provide evidence that cohesins are a missing link in age-related nondisjunction. Nat Genet. 37 (12), 1351-1355 (2005).
- Freeman, S. B., et al. The National Down Syndrome Project: design and implementation. Public Health Rep. 122 (1), 62-72 (2007).
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
- Angell, R. R. First-meiotic-division nondisjunction in human oocytes. Am. J. Hum. Genet. 61, 23-32 (1997).
- Tsutsumi, M., et al. Age-related decrease of meiotic cohesins in human oocytes. PLoS One. 9 (5), e96710 (2014).
- Liu, L., Keefe, D. L. Defective cohesin is associated with age-dependent misaligned chromosomes in oocytes. Reprod Biomed Online. 16 (1), 103-112 (2008).
- Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Aging predisposes oocytes to meiotic nondisjunction when the cohesin subunit SMC1 is reduced. PLoS Genet. 4 (11), e1000263 (2008).
- Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes. Curr. Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).
- Lister, L. M., et al. Age-related meiotic segregation errors in mammalian oocytes are preceded by depletion of cohesin and Sgo2. Curr. Biol. 20 (17), 1511-1521 (2010).
- Duncan, F. E., et al. Chromosome cohesion decreases in human eggs with advanced maternal age. Aging Cell. 11 (6), 1121-1124 (2012).
- Yun, Y., Lane, S. I., Jones, K. T. Premature dyad separation in meiosis II is the major segregation error with maternal age in mouse oocytes. Development. 141 (1), 199-208 (2014).
- Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Heterochromatin-mediated association of achiasmate homologues declines with age when cohesion is compromised. Génétique. 181, 1207-1218 (2009).
- Jeffreys, C. A., Burrage, P. S., Bickel, S. E. A model system for increased meiotic nondisjunction in older oocytes. Curr. Biol. 13 (6), 498-503 (2003).
- Weng, K. A., Jeffreys, C. A., Bickel, S. E. Rejuvenation of Meiotic Cohesion in Oocytes during Prophase I Is Required for Chiasma Maintenance and Accurate Chromosome Segregation. PLoS Genetics. 10 (9), e1004607 (2014).
- Perkins, A. T., Das, T. M., Panzera, L. C., Bickel, S. E. Oxidative stress in oocytes during midprophase induces premature loss of cohesion and chromosome segregation errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), E6823-E6830 (2016).
- Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation. Cell. 86, 135-146 (1996).
- Dernburg, A. F., Sedat, J. W. . Method Cell Biol. 53, 187-233 (1998).
- Guo, Z., Batiha, O., Bourouh, M., Fifield, E., Swan, A. Role of Securin, Separase and Cohesins in female meiosis and polar body formation in Drosophila. J Cell Sci. 129 (3), 531-542 (2016).
- Giauque, C. C., Bickel, S. E. Heterochromatin-Associated Proteins HP1a and Piwi Collaborate to Maintain the Association of Achiasmate Homologs in Drosophila Oocytes. Génétique. 203 (1), 173-189 (2016).
- Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Beliveau, B. J., Wu, C. T. Germline progenitors escape the widespread phenomenon of homolog pairing during Drosophila development. PLoS Genet. 9 (12), e1004013 (2013).
- Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes. Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).
- Gyuricza, M. R., et al. Dynamic and Stable Cohesins Regulate Synaptonemal Complex Assembly and Chromosome Segregation. Curr Biol. 26 (13), 1688-1698 (2016).
- Radford, S. J., McKim, K. S. Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes. J Vis Exp. (116), (2016).
