Fabrication Procedures and Birefringence Measurements for Designing Magnetically Responsive Lanthanide Ion Chelating Phospholipid Assemblies

St&#233;phane Isabettini; Mirjam E. Baumgartner; Peter Fischer; Erich J. Windhab; Marianne Liebi; Simon Kuster

doi:10.3791/56812

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Ingénierie

Des procédures de fabrication et des mesures de biréfringence pour concevoir Ion Lanthanide magnétiquement sensibles phospholipides assemblées de chélation

Published: January 03, 2018

doi:

10.3791/56812

Stéphane Isabettini, Mirjam E. Baumgartner, Peter Fischer, Erich J. Windhab, Marianne Liebi, Simon Kuster

¹Laboratory of Food Process Engineering,ETH Zurich, ²MAX IV Laboratory,Lund University

Summary

Des procédures de fabrication pour ion lanthanide hautement magnétiquement sensibles polymoléculaire assemblées de chélation sont présentés. La réponse magnétique est dictée par la taille de l’Assemblée, qui est adaptée par extrusion à travers des membranes nanopore. Assemblées alignability magnétique et changements structurels induits par la température sont surveillées par des mesures de la biréfringence, une technique gratuite à résonance magnétique nucléaire et de la diffusion des neutrons petit angle.

Abstract

Bicelles sont des assemblages d’accordable disque polymoléculaire formés d’une grande variété de mélanges de lipides. Diverses applications études structurales de protéine de membrane par résonance magnétique nucléaire (RMN) aux développements nanotechnologiques, y compris la formation de gels optiquement actifs et magnétiquement commutables. Ces technologies nécessitent contrôle élevé de la taille de l’Assemblée, la réponse magnétique et la résistance thermique. Mélanges de 1, 2-dimyristoyl –sn– glycéro-3-phosphocholine (DMPC) et son ion lanthanide (Ln^{3 +}) chélatant conjugué de phospholipides, 1, 2-dimyristoyl –sn– glycéro-3-phospho-éthanolamine-diéthylène triaminepentaacetate () DMPE-DTPA), monter dans des assemblys fortement magnétiquement sensibles telles que le DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} (rapport molaire 4:1:1) bicelles. Introduction de cholestérol (Chol-OH) et dérivés stéroïdiens dans la bicouche se traduit par un autre jeu d’assemblys offrant des propriétés physico-chimiques uniques. Pour une composition lipidique donnée, l’alignability magnétique est proportionnel à la taille de bicelle. La complexation de Ln^{3 +} se traduit par des réponses magnétiques sans précédent en termes de grandeur et alignement de direction. L’effondrement de thermo réversible des structures disque-comme dans les vésicules en chauffant permet adaptation des dimensions assemblées par extrusion à travers des membranes filtrantes avec la taille des pores définis. Les bicelles magnétique réglable sont régénérées par refroidissement à 5 ° C, ce qui entraîne l’Assemblée dimensions définies par les précurseurs de la vésicule. Dans les présentes, cette procédure de fabrication est expliquée et l’alignability magnétique des assemblées est quantifié par des mesures de biréfringence sous champ magnétique 5,5 T. Le signal de la biréfringence, provenant de la bicouche phospholipidique, outre permet la surveillance des changements polymoléculaire dans la bicouche. Cette technique simple est complémentaire des expériences RMN qui sont couramment employées pour caractériser bicelles.

Introduction

Bicelles sont des assemblages de type disque polymoléculaire provenant de nombreux mélanges de lipides. ¹ ^, ² ^, ³ ^, ⁴ ^, ⁵ ils sont largement utilisés pour la caractérisation structurale des biomolécules de membrane par spectroscopie RMN. ⁶ ^, ⁷ Toutefois, les efforts récents visent à élargir le champ d’applications possibles. ⁵ ^, ⁸ ^, ⁹ le système de bicelle plus étudié est composé d’un mélange de 1, 2-dimyristoyl –sn– glycéro-3-phosphocholine (DMPC), constituant la partie plane de l’Assemblée et 1, 2-dihexanoyl –sn– glycéro-3-phosphocholine (DHPC) phospholipides qui couvre le bord. ¹ ^, ² ^, ³ la géométrie moléculaire des phospholipides composer la bicouche dicter l’architecture de la structure polymoléculaire auto-assemblés. ⁴ ^, ⁵ remplacement DHPC avec DMPE-DTPA génère systèmes hautement magnétiquement sensibles et accordables bicelle. ¹⁰ ^, ¹¹ DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} (rapport molaire 4:1:1) bicelles associé avec beaucoup plus d’ions paramagnétiques lanthanide (Ln^{3 +}) sur la surface de la bicouche, ayant pour résultat une réponse magnétique accrue. ¹⁰ par ailleurs, en remplaçant les molécules solubles dans l’eau de DHPC avec DMPE-DTPA/Ln^{3 +} permet la formation de bicelles résistant à la dilution. ¹¹

L’alignability magnétique des polymoléculaire planes assemblées est dicté par leur énergie magnétique dans l’ensemble,

(1)

où B est l’intensité du champ magnétique, la n magnétique constant, le nombre d’agrégation et l’anisotropie de la susceptibilité diamagnétique moléculaire des lipides composer la bicouche. Par conséquent, la réponse de DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} bicelles aux champs magnétiques est adaptée par leur taille (nombre total n) et le Δχ d’anisotropie moléculaire susceptibilité diamagnétique. Celle-ci est facilement obtenue en changeant la nature de la Ln chélatés^{3 +}. ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁴ ^, ¹⁵ présentation cholestérol (Chol-OH) ou autres dérivés de stéroïdes dans la bicouche offre la possibilité de régler aussi bien le nombre total n et le Δχ de la susceptibilité magnétique des assemblées. ¹¹ ^, ¹⁶ ^, ¹⁷ ^, ¹⁸ ^, ¹⁹ pour une composition lipidique donnée, plus grandes assemblées contiennent plus de lipides pouvant contribuer à l’E-_mag (plus gros agrégat nombre n), résultant en des espèces plus réglable. La taille de DMPC/DHPC bicelles, par exemple, est conventionnellement contrôlée grâce à l’optimisation de la concentration composition de ratio ou total des lipides. ²⁰ ^, ²¹ ^, ²² même si cela est possible en DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} bicelles, leur transformation thermo réversible de bicelle aux vésicules par chauffage offres ajouté des options de personnalisation. Les moyens mécaniques tels que l’extrusion à travers des filtres de membrane permet de façonner des vésicules. Les bicelles magnétique réglable sont régénérées après refroidissement à 5 ° C et leurs dimensions sont dictées par les précurseurs de la vésicule. ¹¹ Herein, nous nous concentrons sur le potentiel des procédures de fabrication mécanique avec DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapport molaire 4:1:1) ou DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapport molaire 16:4:5:5) sous forme de systèmes de référence. Le processus fonctionne par analogie lorsque vous travaillez avec autres Ln^{3 +} que Tm^{3 +}. Le large éventail des possibilités offertes par ces techniques sont mises en évidence dans la Figure 1 et largement discutées ailleurs. ²³

Figure 1 : aperçu schématique des procédures de fabrication possible. Étudiés par magnétisme réglable Ln^{3 +} chélateur polymoléculaire assemblées sont composées de deux DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapport molaire 4:1:1) ou DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapport molaire 16:4:5:5). Le film lipidique sec est hydraté avec une mémoire tampon au phosphate 50 mM à un pH de 7,4 et la concentration de lipides totaux est de 15 mM. Une hydratation efficace du film lipidique nécessite soit gel dégel cycles (FT) ou chauffage et refroidissement des cycles (H & C). H & C cycles sont nécessaires pour régénérer les échantillons après le dernier gel dégel étape, ou pour régénérer les échantillons congelés pendant une période prolongée de temps s’ils doivent être utilisés sans davantage d’extrusion. Ces étapes sont longuement débattus par Isabettini et al. ²³ polymoléculaire au maximum réglable assemblées soient atteints, livrant des architectures assembly différent basés sur la composition des lipides. La taille de bicelle et alignability magnétique est accordable par extrusion (Ext) à travers des filtres de membrane nanopore. L’alignement présenté facteurs A_f ont été calculées de 2D petit angle neutron scattering (San) modèles d’un DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapport molaire 16:4:5:5) échantillon extrudé à travers soit 800, 400, 200 ou 100 nm pores. SANS mesures sont un moyen complémentaire de quantifier l’alignement de bicelle qui ne sera pas couvert plus en détail ci-après. ¹¹ ^, ¹⁶ A la_f varie entre -1 (diffusion de neutrons parallèle ou perpendiculaire alignement de le bicelles à l’égard de la direction du champ magnétique) et 0 pour la diffusion isotrope.S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

La structure de bicelles a été étudiée par un large éventail de techniques de caractérisation. ¹³ l’alignement de bicelles exposés à un champ magnétique a été quantifiée à l’aide de la spectroscopie RMN ou expériences de diffusion (San) de neutrons petit angle. ⁵ ^, ¹⁰ ^, ¹¹ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁶ ^, ¹⁷ ^, ¹⁸ ^, ¹⁹ ^, ²⁴ ^, ²⁵ Toutefois, le déplacement et l’élargissement des pics NMR qui se produisent en présence de Ln^{3 +} sont la méthode de sérieuses limites. ¹⁵ ^, ²⁶ ^, ²⁷ ^, ²⁸ bien que SANS expériences ne souffrent pas de cette limitation, alternative et des techniques plus accessibles sont souhaitables pour la quantification systématique de l’alignement magnétique induit des assemblys dans la solution. Les mesures de biréfringence sont une alternative viable et relativement simple. Par analogie à des expériences RMN, mesures de biréfringence révèlent des renseignements précieux sur les réarrangements de lipides et de phases lipidiques qui se produisent dans la bicouche. En outre, les transformations géométriques qui se produisent dans l’assembly polymoléculaire avec l’évolution des conditions environnementales comme la température sont contrôlées. ¹¹ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁶ Δn′ de biréfringence induite par magnétisme a été utilisé pour étudier les différents types de systèmes de phospholipides. ¹³ ^, ²⁹ ^, ³⁰ mesures de biréfringence basées sur la technique de modulation de phase dans un champ magnétique est une méthode viable pour détecter l’orientation de bicelles. ¹² ^, ¹⁶ ^, ¹⁸ ^, ²⁹ ^, ³¹ ^, ³² la possibilité d’enquêter sur les bicelles avec la biréfringence dans des champs magnétiques élevés jusqu’à 35 T a aussi été démontrée par Laura M. et al. ¹³

Lorsque la lumière polarisée entre dans un matériau anisotrope, il va être réfracté dans une vague ordinaire et extraordinaire. ¹¹ les deux ondes ont des vitesses différentes et sont décalés en phase par un retard δ. Le degré de retard δ est mesuré et converti en un signal de biréfringence pour quantifier le degré d’anisotropie dans la matière à l’aide

(2)

où λ est la longueur d’onde du laser et d est l’épaisseur de l’échantillon. Les phospholipides sont optiquement anisotropes et leur axe optique coïncide avec leurs haches longtemps moléculaires, parallèles à la queue d’hydrocarbure. ¹¹ ^, ¹² aucun retard n’est mesuré si les phospholipides sont orientées au hasard dans la solution. Un retard est mesuré lorsque les phospholipides sont alignés parallèlement les uns aux autres. La biréfringence magnétique induite peut avoir un signe positif ou négatif selon l’orientation des molécules dans le champ magnétique ; Voir la Figure 2. Phospholipides alignés parallèlement à l’axe des abscisses donnera lieu à un négatif , même si ces alignés le long de l’axe z positif . Aucun biréfringence n’est observée lorsque l’axe optique coïncide avec la direction de propagation de lumière comme le phospholipide s’aligne parallèlement à l’axe y.

Figure 2 : Alignement des phospholipides et signe correspondant de la biréfringence magnétique induite . Le signe des dépend de l’orientation des phospholipides dans le champ magnétique. Les lignes pointillées indiquent l’axe optique de la molécule. La lumière est polarisée à 45° et se propage dans la direction y. Le champ magnétique B est dans la direction z. Ce chiffre a été modifié par M. Laura. ¹¹ s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Dans le cas d’une suspension colloïdale isotrope de bicelles, l’orientation induite par l’arrangement des phospholipides dans la bicouche sera perdue, remise à zéro de l’arriération δ. Le bicelles doit également aligner afin d’orienter les phospholipides optiquement actifs dans leurs bicouches, provoquant un retard δ de la lumière polarisée. En conséquence, la biréfringence est un outil sensible pour quantifier l’alignability magnétique des assemblées polymoléculaire. Bicelles alignés perpendiculairement au champ magnétique permettra d’obtenir un positif , tandis que ceux alignés parallèlement donnera un négatif . Le signe dépend de l’alignement de l’installation et peut être vérifié auprès d’un échantillon de référence.

Protocol

1. procédure fabrication de DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapport molaire 4:1:1) et DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapport molaire 16:4:5:5) polymoléculaire assemblées Préparations préliminaires Laver toute la verrerie en rinçant une fois avec de l’éthanol stabilisé chloroforme (> 99 % chloroforme) et sécher à l’air comprimé. Produire 2 solutions mères distinctes de 10 mg/mL de DMPC et DMPE-DTPA dans le chloroforme éthanol-stabilisé (> chloroforme de…

Representative Results

Le signal de la biréfringence d’un non extrudé DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapport molaire 4:1:1) échantillon a été suivie sous champ magnétique 5,5 T pendant un chauffage et de refroidissement cycle de 5 à 40 ° C et à une vitesse de 1 ° C/min (Figure 6). Les résultats de la biréfringence ont confirmé des alignements magnétiques élevés à 5 ° C avec une valeur de 1,5 x de 10-5, deux fois aussi forte en ce qui concerne les sy…

Discussion

Un compte rendu détaillé de comment biréfringence mesures ont été utilisées en combinaison avec SANS expériences pour évaluer des méthodes pour la génération hautement magnétiquement sensibles Ln^{3 +}chélateurs phospholipides ensembles est en Isabettini et al. ²³ les protocoles de fabrication proposées sont également applicables pour les assemblys composés des phospholipides DPPC et DPPE-DTPA plus longtemps ou pour ceux contenant des dérivés de stéroïdes chim…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs reconnaissent la Swiss National Science Foundation pour financement SMhardBi (numéro de projet 200021_150088/1). SANS expériences ont été effectuées à la source de neutrons de spallation Suisse SINQ, Paul Scherrer Instute, Villigen, Suisse. Les auteurs remercient chaleureusement le Dr. Joachim Kohlbrecher pour ses conseils avec les expériences SANS. L’installation de mesure de la biréfringence sous des champs magnétiques élevés a été inspirée de la configuration existante au haut champ magnétique laboratoire HFML, Nijmegen, Pays-Bas. Nous remercions Bruno Pfister pour son aide dans le développement de l’électronique de l’installation de la biréfringence, Jan Corsano et Daniel Kiechl pour construire les cadres permettant un alignement fin et facile du laser et Dr. Bernhard Koller pour soutien technique continu.

Materials

1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)	Avanti Polar Lipids	850345P	>99%
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-ethanolamine-diethylene triaminepentaacetate acid hexammonium salt (DMPE-DTPA)	Avanti Polar Lipids	790535P	>99%
Thulium(III) chloride	Sigma-Aldrich	439649	anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
Dysprosium(III) chloride	Sigma-Aldrich	325546	anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
Ytterbium(III) chloride	Sigma-Aldrich	439614	anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
Chloroform	Sigma-Aldrich	319988	contains ethanol as stabilizer, ACS reagent, ≥99.8%
Methanol	Sigma-Aldrich	34860	≥99.9%
Cholesterol	Amresco	433	Ultra pure grade
D2O	ARMAR chemicals	1410	99.8 atom % D
Ultrapure water	Millipore		Synergy pak2 (SYPK0SIX2), Millipack GP (MPGP02001)
electronic pH meter	Metrohm	17440010
Whatmann Nuclepore 25 mm 100nm membrane filter	VWR	515-2028
Whatmann Nuclepore 25 mm 200nm membrane filter	VWR	515-2029
Whatmann Nuclepore 25 mm 400nm membrane filter	VWR	515-2030
Whatmann Nuclepore 25 mm 800nm membrane filter	VWR	515-2032
Whatmann Filter paper	VWR	230600
25 ml round bottom flask	VWR	201-1352	14/23 NS
3 ml glass snap-cup	VWR	548-0554	ND18, 18x30mm
2.5 ml glass syringe	Hamilton
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate	Merk	1.06342	Salt used to make phosphate buffer
di-Sodium hydrogen phosphate	Merk	1.06586	Salt used to make phosphate buffer
Liquid Nitrogen	Carbagas	–
Pressurized Nitrogen gas	Carbagas	–	200 bar bottle
Lipid Extruder 10 ml	Lipex	–	Fully equipped with thermobarrel
High-pressure PVC tube	GR NETUM	–	must resist more than 4 MPa
Serto adaptors	Sertot	–
Nitrile gloves	VWR	–
2 ml glass pipettes	VWR	612-1702	230 mm long
Diode Laser	Newport	LPM635-25C
DSP Dual Phase Lock-in Amplifier	SRS	SR830
Photodiode Detector	Silonex Inc.	SLSD-71N5	5mm2, Silicon, photo-conductive
5.5 T Cryogenic Magnetic	Cryogenic/Oerlikon AG	–	12 bar He-cooled. RW4000/6000 compressor, RGD 5/100 TA cryo-head
Second order low pass filter	home-built	–	Linear power supply 24V DC, second order, Sallen Key, cut-off frequency 360 Hz, +/- 12V, max 10 mA
Photoelastic modulator	Hinds instruments	PEM-90
Glan-Thompson Calcite Polarizer	Newport	10GT04	25.4mm diameter
Quartz sample cuvette	Hellma	165-10-40	temperature controlled cell, 0.8 ml, 10mm path length
Temperature probe	Thermocontrol	–	Type K, 0.5mm diameter, Thermocoax
Non-polarizing mirrors	Newport	50326-1002	25.4mm
RS 232 cables	National Instruments	189284-02	For Connecting to the RS-232 Port on the front of Compact FieldPoint Controllers
BNC 50 Ω cable and connectors	National Instruments	763389-01
cFP-AI-110	National Instruments	777318-110	8-Channel Analog Voltage and Current Input Module for Compact FieldPoint
cFP-CB-1	National Instruments	778618-01	Integrated Connector Block for Wiring to Compact FieldPoint I/O
cFP-CB-3	National Instruments	778618-03	Integrated Isothermal Connector Block for Wiring Thermocouples to the cFP-TC-120 Module
cFP-TC-120	National Instruments	777318-120	8-Channel Thermocouple Input Module for Compact FieldPoint
cFP-1804	National Instruments	779490-01	Ethernet/Serial Interface for NI Compact FieldPoint
LabView 2010	National Instruments	–
Industrial power supply	Traco Power	TCL 060-124	100-240V AC
Waterbath	Julabo	FP40-HE	refrigerated/Heating Circulator

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Citer Cet Article

Isabettini, S., Baumgartner, M. E., Fischer, P., Windhab, E. J., Liebi, M., Kuster, S. Fabrication Procedures and Birefringence Measurements for Designing Magnetically Responsive Lanthanide Ion Chelating Phospholipid Assemblies. J. Vis. Exp. (131), e56812, doi:10.3791/56812 (2018).