Fertigung-Verfahren und Doppelbrechung Messungen für die Gestaltung von magnetisch reagieren Lanthanoid-Ionen chelatisierenden Phospholipid-Baugruppen

Summary

Fertigung-Verfahren für stark magnetisch reagieren Lanthanoid-Ionen chelatisierenden Polymolecular Baugruppen werden vorgestellt. Die magnetische Antwort richtet sich nach der Montage Größe, die durch Extrusion durch Nanopore Membranen zugeschnitten ist. Die Assemblys magnetische Alignability und temperaturbedingte strukturelle Veränderungen werden durch Doppelbrechung Messungen, eine kostenlose Technik, NMR- und kleinen Winkel Neutronenstreuung überwacht.

Abstract

Bicelles sind abstimmbaren scheibenartigen Polymolecular Baugruppen gebildet aus einer Vielzahl von Lipid-Mischungen. Anwendungen reichen von Membran-Protein strukturelle Studien durch Kernspinresonanz (NMR), nanotechnologischen Entwicklungen einschließlich der Bildung von optisch aktiven und magnetisch umschaltbar Gele. Solche Technologien erfordern hohe Kontrolle der Montage Größe, magnetische Resonanz und thermischen Widerstand. Mischungen von 1,2-Dimyristoyl –sn– Glycero-3-Phosphocholin (DMPC) und seine Lanthanoid-Ionen (Ln^{3 +}) chelatisierenden Phospholipid-Konjugat, 1,2-Dimyristoyl –sn– Glycero-3-Phospho-Ethanolamin-Diethylenglykol Triaminepentaacetate () DMPE-DTPA), in stark magnetisch reagieren Baugruppen wie DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} montieren (molares Verhältnis 4:1:1) Bicelles. Einführung von Cholesterin (Chol-OH) und Steroid-Derivate in der Bilayer führt zu einem anderen Satz von Assemblys bietet einzigartige physikalisch-chemischen Eigenschaften. Für eine gegebene Lipidzusammensetzung ist die magnetische Alignability proportional zur Bicelle Größe. Die Komplexierung von Ln^{3 +} führt zu noch nie da gewesenen magnetische Antworten in Bezug auf Größe und Ausrichtung Richtung. Die Thermo-Reversible reduzieren der scheibenartigen Strukturen in Vesikeln beim Erhitzen können Anpassung die Assemblys Dimensionen durch Extrusion durch Membranfilter mit definierten Porengrößen. Die magnetisch anreihbar Bicelles werden regeneriert, durch kühlen auf 5 ° C, wodurch Einbaumaße durch die Vesikel Vorläufer definiert. Hierin, dieses Fertigung-Verfahren erläutert und die magnetische Alignability der Baugruppen wird durch Doppelbrechung Messungen unter 5,5 T Magnetfeld quantifiziert. Die Doppelbrechung Signal, aus dem Phospholipid Bilayer ermöglicht weitere Überwachung der Polymolecular Veränderungen in der Bilayer. Diese einfache Technik ist komplementär zur NMR-Experimente, die häufig eingesetzt werden, um Bicelles zu charakterisieren.

Introduction

Bicelles sind scheibenartige Polymolecular Baugruppen aus zahlreiche Lipid-Mischungen gewonnen. ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} sie sind für die strukturelle Charakterisierung von Membran Biomoleküle durch NMR-Spektroskopie verbreitet. ^{6 , 7} jüngste Bemühungen sollen jedoch das Feld der Anwendungsmöglichkeiten zu erweitern. ^{5 , 8 , 9} das am meisten untersuchte Bicelle System besteht aus einer Mischung von 1,2-Dimyristoyl –sn– Glycero-3-Phosphocholin (DMPC), die planar Bestandteil der Versammlung und 1,2-Dihexanoyl –sn– Glycero-3-Phosphocholin (DHCP) Phospholipid über den Rand. ^{1 , 2 , 3} die molekulare Geometrie der Phospholipide, die Komposition der Bilayer bestimmen die Architektur der selbstgebaute Polymolecular Struktur. ^{4 , 5} Ersatz DHCP mit DMPE-DTPA erzeugt sehr magnetisch reagieren und einstellbaren Bicelle Systeme. ^{10 , 11} DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} (molares Verhältnis 4:1:1) Bicelles assoziieren mit vielen mehr paramagnetischen Lanthanoid-Ionen (Ln^{3 +}) auf der Bilayer Oberfläche, wodurch eine verbesserte magnetische Antwort. ¹⁰ im übrigen ersetzt die wasserlösliche DHCP-Moleküle mit DMPE-DTPA/Ln^{3 +} ermöglicht die Bildung von Verdünnung-resistente Bicelles. ¹¹

Die magnetische Alignability planare Polymolecular Baugruppen wird durch ihre insgesamt magnetische Energie diktiert,

(1)

wo B die magnetische Feldstärke ist, die magnetische Konstante, n die Aggregation Anzahl und der molekularen diamagnetische Suszeptibilität Anisotropie der Lipide der Bilayer zu komponieren. Daher ist die Reaktion der DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} Bicelles auf magnetische Felder durch ihre Größe (aggregierte Zahl n) und der molekularen diamagnetische Suszeptibilität Anisotropie Δχ zugeschnitten. Letzteres wird leicht durch Änderung der Art der Chelat Ln^{3 +}erreicht. ^{12 , 13 , 14 , 15} Introducing Cholesterin (Chol-OH) oder anderen Steroid Derivate in der Bilayer bietet die Möglichkeit des Tunings die aggregierte Anzahl n und der magnetischen Suszeptibilität Δχ der Baugruppen. ^{11 , 16 , 17 , 18 , 19} für einen gegebenen Lipidzusammensetzung enthalten größere Baugruppen mehr Lipide in der Lage, einen Beitrag zur E-_Mag (größer aggregierte Zahl n), was zu mehr Einlaufkästen Arten. Die Größe der DMPC/DHCP Bicelles ist z. B. konventionell durch Optimierung der kompositorischen Lipidkonzentration Verhältnis oder insgesamt gesteuert. ^{20 , 21 , 22} auch wenn dies in DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} Bicelles möglich ist, ihre Thermo-Reversible Umwandlung von Bicelle zu Bläschen auf Heizung Angebote Schneiderei Optionen hinzugefügt. Mechanische bedeutet wie Extrusion durch Membranfilter ermöglicht die Gestaltung der Vesikel. Die magnetisch anreihbar Bicelles werden beim Abkühlen auf 5 ° C regeneriert und ihre Dimensionen sind aus der Vesikel-Vorstufen diktiert. ¹¹ Herein, wir konzentrieren uns auf das Potenzial der mechanischen Fertigung Verfahren mit DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (molares Verhältnis 4:1:1) oder DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (Molverhältnis 16:4:5:5) als Bezugssysteme. Der Prozess funktioniert analog bei der Arbeit mit anderen Ln^{3 +} als Tm^{3 +}. Die breite Palette von Möglichkeiten, die diese Techniken sind in Abbildung 1 hervorgehoben und an anderer Stelle ausführlich erläutert. ²³

Abbildung 1: Schematische Übersicht über die möglichen Herstellung Verfahren. Die studierten magnetisch Einlaufkästen Ln^{3 +} Komplexbildner Polymolecular Baugruppen bestehen aus entweder DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (molares Verhältnis 4:1:1) oder DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (Molverhältnis 16:4:5:5). Die trockenen Lipid-Film wird mit einem 50 mM-Phosphat-Puffer auf einen pH-Wert von 7,4 hydratisiert und die gesamten Lipidkonzentration beträgt 15 mM. Eine effektive Hydratation der Lipid-Film erfordert entweder Einfrieren Auftauen Zyklen (FT) oder Heizen und kühlen Zyklen (H & C). H & C Zyklen sind notwendig, Proben nach dem letzten Einfrieren Auftauen Schritt regenerieren oder regenerieren Proben über einen längeren Zeitraum hinweg eingefroren aufbewahrt, wenn sie ohne weitere Extrusion verwendet werden sollen. Diese Schritte werden von Isabettini Et al.ausgiebig diskutiert. ²³ maximal anreihbar Polymolecular Baugruppen werden erreicht, liefern verschiedene Montage-Architekturen basierend auf der Lipidzusammensetzung. Die Bicelle Größe und magnetische Alignability ist abstimmbaren durch Extrusion (Ext) durch Nanopore Membranfilter. Dargestellten Ausrichtung Faktoren A_f wurden berechnet aus 2D kleiner Winkel Neutron (SANS) Streubildern einer DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (Molverhältnis 16:4:5:5) Probe extrudiert über 800, 400, 200 oder 100 nm Poren. SANS Messungen sind ergänzende Mittel zur Quantifizierung der Bicelle Ausrichtung, die im Detail hier nicht abgedeckt werden. ^{11 , 16} die A-_f reicht von-1 (parallele Neutronenstreuung oder senkrechte Ausrichtung des Bicelles in Bezug auf die Richtung des Magnetfeldes) bis 0 für isotrope Lichtstreuung.Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur.

Die Struktur des Bicelles wurde durch eine Vielzahl von Charakterisierung Techniken ausgiebig untersucht. ¹³ die Ausrichtung des Bicelles, einem Magnetfeld ausgesetzt wurde quantifiziert, entweder mithilfe NMR-Spektroskopie oder kleinen Winkel Neutron Streuexperimente (SANS). ^{5 , 10 , 11 , 12 , 13 , 16 , 17 , 18 , 19 , 24 , 25} sind jedoch die Verschiebung und Verbreiterung der NMR Spitzen Auftritt im Beisein von Ln^{3 +} gravierende Einschränkungen der Methode. ^{15 , 26 , 27 , 28} obwohl SANS Experimente nicht leiden diese Einschränkung, alternative und mehr zugängliche Techniken sind wünschenswert für routinemäßige Quantifizierung von magnetisch induzierte Ausrichtung von Baugruppen in Lösung. Doppelbrechung Messungen sind eine vergleichsweise einfache und praktikable Alternative. Analog zeigen NMR-Experimente, Doppelbrechung Messungen wertvolle Informationen über Lipid Umgestaltungen und Lipid-Phasen in der Bilayer auftreten. Darüber hinaus sind geometrische Transformationen, die in der Polymolecular-Versammlung mit wechselnden Umweltbedingungen wie Temperatur überwacht. ^{11 , 12 , 13 , 16} magnetisch induzierte Doppelbrechung Δn′ wurde verwendet, um verschiedene Arten von Phospholipid-Systeme zu studieren. ^{13 , 29 , 30} Doppelbrechung Messungen auf der Grundlage der Phasenmodulation Technik in einem Magnetfeld ist eine praktikable Methode, um Ausrichtung des Bicelles zu erkennen. ^{12 , 16 , 18 , 29 , 31 , 32} die Möglichkeit der Untersuchung von Bicelles mit Doppelbrechung in hohen Magnetfeldern bis zu 35 T zeigte auch von M. Liebi Et al. ¹³

Wenn polarisiertes Licht ein anisotropen Materials tritt, wird es in einer ordentlichen und außerordentlichen Welle gebrochen. ¹¹ die zwei Wellen haben unterschiedliche Geschwindigkeiten und werden durch eine Verzögerung δ in Phase verschoben. Der Grad der Behinderung δ gemessen und in eine Doppelbrechung Signal umgewandelt , den Grad der Anisotropie in der materiellen mit zu quantifizieren

(2)

wo λ ist die Wellenlänge des Lasers und d ist die Dicke der Probe. Phospholipide sind optisch anisotropen und ihre optische Achse deckt sich mit ihren langen molekularen Achsen parallel zu den Kohlenwasserstoff-Schwänzen. ^{11 , 12} keine Retardierung wird gemessen, wenn die Phospholipide in Lösung nach dem Zufallsprinzip orientiert sind. Retardierung wird gemessen, wenn Phospholipide parallel zueinander ausgerichtet sind. Der magnetisch induzierte Doppelbrechung haben einen positiven oder negativen Vorzeichen abhängig von der Orientierung der Moleküle in das magnetische Feld; siehe Abbildung 2. Phospholipide, die parallel zur x-Achse ausgerichtet führt zu einer negativen , während die ausgerichteten entlang der z-Achse zur Folge haben einer positives . Keine Doppelbrechung wird beobachtet, wenn die optische Achse mit der Richtung der Lichtausbreitung fällt, wie die Phospholipid Parallel zur y-Achse ausgerichtet.

Abbildung 2: Ausrichtung der Phospholipide und der entsprechenden Zeichen der magnetisch induzierte Doppelbrechung . Das Zeichen des gemessenen richtet sich nach der Ausrichtung des Phospholipid im Magnetfeld. Gestrichelte Linien zeigen die optische Achse des Moleküls. Das Licht ist um 45° polarisiert und breitet sich in y-Richtung. Das Magnetfeld B befindet sich in Z-Richtung. Diese Zahl wurde von M. Liebi geändert. ¹¹ Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Im Falle einer isotropen kolloidale Suspension von Bicelles wird die Ausrichtung durch die Anordnung der Phospholipide in der Bilayer induzierte Nullung Retardierung δ verloren gehen. Die Bicelles müssen auch ausrichten, um die optisch aktive Phospholipide in ihre Bilayer, verursacht eine Verzögerung δ von polarisiertem Licht orientieren. Infolgedessen ist die Doppelbrechung sensible Werkzeug, das magnetische Alignability Polymolecular Baugruppen zu quantifizieren. Bicelles ausgerichtet senkrecht zum Magnetfeld ergibt eine Positive , während die parallel ausgerichtet eine Negative erbringt . Das Schild hängt von der Ausrichtung des Setups und kann mit einer Referenzprobe überprüft werden.

Protocol

1. Herstellung Verfahren für DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molares Verhältnis 4:1:1) und DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (Molverhältnis 16:4:5:5) Polymolecular Baugruppen Erste Vorbereitungen Waschen der Gläser durch Spülen einmal mit Ethanol stabilisiert Chloroform (> 99 % Chloroform) und mit Druckluft trocknen. 2 unterschiedliche 10 mg/mL Stammlösungen der DMPC und DMPE-DTPA in Ethanol-stabilisiertes Chloroform zu produzieren (> 99 % Chloroform), eine 10 mM-Stam…

Representative Results

Die Doppelbrechung Signal eines nicht-extrudierte DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molares Verhältnis 4:1:1) Probe wurde unter 5,5 T Magnetfeld überwacht, während eine Erwärmung und Abkühlung Zyklus von 5 bis 40 ° C und zurück mit einer Rate von 1 ° C/min (Abbildung 6). Die Doppelbrechung Ergebnisse bestätigten hohen magnetischen Achsen bei 5 ° C mit einem Wert von 1,5 x 10-5, doppelt so stark wie bei den gemeldeten extrudierten Systemen….

Discussion

Eine detaillierte Darstellung der wie Doppelbrechung Messungen in Kombination mit SANS verwendet wurden Experimente um zu bewerten Methoden zur Erzeugung von sehr magnetisch reagieren Ln^{3 +} chelatisierenden Phospholipide Baugruppen ist in Isabettini Et al. ²³ die vorgeschlagene Herstellung Protokolle gelten auch für Baugruppen bestehend aus der längeren DPPC und BPUK-DTPA Phospholipide oder für solche, die chemisch veränderter Steroid Derivate in ihren Bilayer. <sup class="…

Materials

1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)	Avanti Polar Lipids	850345P	>99%
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-ethanolamine-diethylene triaminepentaacetate acid hexammonium salt (DMPE-DTPA)	Avanti Polar Lipids	790535P	>99%
Thulium(III) chloride	Sigma-Aldrich	439649	anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
Dysprosium(III) chloride	Sigma-Aldrich	325546	anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
Ytterbium(III) chloride	Sigma-Aldrich	439614	anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
Chloroform	Sigma-Aldrich	319988	contains ethanol as stabilizer, ACS reagent, ≥99.8%
Methanol	Sigma-Aldrich	34860	≥99.9%
Cholesterol	Amresco	433	Ultra pure grade
D2O	ARMAR chemicals	1410	99.8 atom % D
Ultrapure water	Millipore		Synergy pak2 (SYPK0SIX2), Millipack GP (MPGP02001)
electronic pH meter	Metrohm	17440010
Whatmann Nuclepore 25 mm 100nm membrane filter	VWR	515-2028
Whatmann Nuclepore 25 mm 200nm membrane filter	VWR	515-2029
Whatmann Nuclepore 25 mm 400nm membrane filter	VWR	515-2030
Whatmann Nuclepore 25 mm 800nm membrane filter	VWR	515-2032
Whatmann Filter paper	VWR	230600
25 ml round bottom flask	VWR	201-1352	14/23 NS
3 ml glass snap-cup	VWR	548-0554	ND18, 18x30mm
2.5 ml glass syringe	Hamilton
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate	Merk	1.06342	Salt used to make phosphate buffer
di-Sodium hydrogen phosphate	Merk	1.06586	Salt used to make phosphate buffer
Liquid Nitrogen	Carbagas	–
Pressurized Nitrogen gas	Carbagas	–	200 bar bottle
Lipid Extruder 10 ml	Lipex	–	Fully equipped with thermobarrel
High-pressure PVC tube	GR NETUM	–	must resist more than 4 MPa
Serto adaptors	Sertot	–
Nitrile gloves	VWR	–
2 ml glass pipettes	VWR	612-1702	230 mm long
Diode Laser	Newport	LPM635-25C
DSP Dual Phase Lock-in Amplifier	SRS	SR830
Photodiode Detector	Silonex Inc.	SLSD-71N5	5mm2, Silicon, photo-conductive
5.5 T Cryogenic Magnetic	Cryogenic/Oerlikon AG	–	12 bar He-cooled. RW4000/6000 compressor, RGD 5/100 TA cryo-head
Second order low pass filter	home-built	–	Linear power supply 24V DC, second order, Sallen Key, cut-off frequency 360 Hz, +/- 12V, max 10 mA
Photoelastic modulator	Hinds instruments	PEM-90
Glan-Thompson Calcite Polarizer	Newport	10GT04	25.4mm diameter
Quartz sample cuvette	Hellma	165-10-40	temperature controlled cell, 0.8 ml, 10mm path length
Temperature probe	Thermocontrol	–	Type K, 0.5mm diameter, Thermocoax
Non-polarizing mirrors	Newport	50326-1002	25.4mm
RS 232 cables	National Instruments	189284-02	For Connecting to the RS-232 Port on the front of Compact FieldPoint Controllers
BNC 50 Ω cable and connectors	National Instruments	763389-01
cFP-AI-110	National Instruments	777318-110	8-Channel Analog Voltage and Current Input Module for Compact FieldPoint
cFP-CB-1	National Instruments	778618-01	Integrated Connector Block for Wiring to Compact FieldPoint I/O
cFP-CB-3	National Instruments	778618-03	Integrated Isothermal Connector Block for Wiring Thermocouples to the cFP-TC-120 Module
cFP-TC-120	National Instruments	777318-120	8-Channel Thermocouple Input Module for Compact FieldPoint
cFP-1804	National Instruments	779490-01	Ethernet/Serial Interface for NI Compact FieldPoint
LabView 2010	National Instruments	–
Industrial power supply	Traco Power	TCL 060-124	100-240V AC
Waterbath	Julabo	FP40-HE	refrigerated/Heating Circulator