الإثراء من البروتينات الدهنية البكتيرية وإعداد ليبوبيبتيديس الطرفي ن للتصميم الهيكلي بالطيف الكتلي
Summary
ويرد في إثراء البكتيرية البروتينات الدهنية باستخدام مرحلة السطح غير الأيونية تقسيم الأسلوب للاستخدام المباشر في فحوصات TLR أو التطبيقات الأخرى. ترد تفاصيل اتخاذ مزيد من الخطوات لإعداد ليبوبيبتيديس تريبتيك الطرفي ن لتوصيف الهيكلية بالطيف الكتلي.
Abstract
البروتينات الدهنية هي مكونات هامة في المغلف الخلية البكتيرية والمنشطات القوية للاستجابة المناعية الفطرية الثدييات. على الرغم من أهميتها لخلية علم وظائف الأعضاء وعلم المناعة، ما زال يمكن اكتشافها حول أشكال البروتين الدهني الرواية، وكيف أنها يتم تصنيعه وتأثير مختلف أشكال على الحصانة المضيف. لتمكين دراسات مستفيضة عن البروتينات الدهنية، يصف هذا البروتوكول وسيلة للإثراء بروتين دهني البكتيرية وإعداد ليبوبيبتيديس تريبتيك الطرفي ن للتصميم الهيكلي بالليزر ساعد مصفوفة الامتزاز التأين-وقت الرحلة الطيف الكتلي (TOF استخدام MS). التوسع في مرحلة X-114 تريتون المنشأة تقسيم أسلوب لاستخراج البروتين الدهني والإثراء من غشاء الخلية البكتيرية، يتضمن البروتوكول خطوات إضافية لإزالة الملوثات غير البروتين الدهني، زيادة إنتاج البروتين الدهني و النقاء. منذ البروتينات الدهنية تستخدم عادة في فحوصات مثل عدد القتلى مستقبلات (TLR)، من المهم أولاً وصف الهيكل الطرفي ن باستخدام TOF السيدة هيرين، يقدم أسلوب عزل الببتيدات مسعور تتركز المخصب الطرفي ن تنقل إلى غشاء النيتروسليلوز ليبوبيبتيديس مناسبة للتحليل المباشر باستخدام TOF MS/السيدة “البروتينات الدهنية” التي فصلت بالصوديوم دوديسيل كبريتات بولي اكريلاميد “هلام استشراد” (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة)، وهضمها في الموقع مع التربسين، التتابع غسلها لإزالة الببتيدات تريبتيك القطبية، وأخيراً التيد مع كلوروفورم-الميثانول. عندما يقترن مع مرض التصلب العصبي المتعدد من الببتيدات تريبسينيزيد القطبية أكثر من الحلول الغسيل، هذا الأسلوب يوفر القدرة على التعرف بروتين دهني وتميز ن نهايته في تجربة واحدة. الصوديوم المتعمد adduct تكوين يمكن أن تستخدم أيضا كأداة لتعزيز أكثر تجزئة المعلومات هيكلياً الأطياف. في نهاية المطاف، سوف تسمح الإثراء من البروتينات الدهنية وتحديد هياكلها الطرفي ن دراسات مستفيضة أكثر في هذه الفئة في كل مكان من البروتينات البكتيرية.
Introduction
البكتيرية من البروتينات الدهنية تتميز حفظت الطرفي ن تعديل المادة الدهنية سيستين أن المراسي المجال بروتين كروي على سطح غشاء الخلية. وتوزع عالمياً في البكتيريا، والتي تشكل 2 إلى 5 في المائة من جميع الجينات الخلوية داخل جينوم نموذجية1. البروتينات الدهنية تلعب أدواراً حاسمة في مجموعة واسعة من العمليات الخلوية، بما في ذلك امتصاص المغذيات، توصيل الإشارة، الجمعية من البروتين المجمعات، وفي الحفاظ على الخلية المغلف السلامة الهيكلية2. البكتيريا المسببة للأمراض، والبروتينات الدهنية بمثابة عوامل الفوعة3،4. خلال عدوى، الاعتراف ليبوبيبتيديس الطرفي ن بعدد القتلى مثل مستقبلات (TLR) 2 تحرض استجابة مناعية فطرية لإزالة مسببات الأمراض الغازية. البروتينات الدهنية اعتماداً على الطرفي ن الدولة أسيليشن، والمعترف بها عموما بالمجمعات هيتيروديميريك TLR2 البديل. تسلم TLR2-TLR1 ليبوبيبتيديس أسيلاتيد ن، بينما يربط TLR2 TLR6 ليبوبيبتيدي حرة α الأمينية تيرميني. مرة ملزمة، تتلاقى مسارات إرسال الإشارات للحث على إفراز السيتوكينات proinflammatory3،4.
أنه كان يعتقد في السابق أن البروتينات الدهنية من البكتيريا إيجابية كانت دياسيلاتيد وتلك من البكتيريا سلبية الغرام كانت ترياسيلاتيد، متباينة في غياب أو وجود حمض الدهنية مرتبطة أميد على بقايا سيستين الطرفي ن مصانة. وأيد هذا الافتراض عدم وجود تسلسل أورثولوجس في جينومات إيجابية لخاصة، ترانسفيراز اشيل ن الغرام التي تشكل البروتينات الدهنية ترياسيلاتيد5. ومع ذلك، فقد كشفت الدراسات الأخيرة ترياسيليشن البروتين الدهني في Firmicutes إيجابية أن نقص خاصة، فضلا عن ثلاثة رواية الطرفي ن بروتين دهني الهياكل، ووصف بيبتيديل و lyso ن-أسيتيل أشكال6،7 ،8. هذه الاستنتاجات تثير تساؤلات بشأن الأشكال المحتملة بعد اكتشاف بروتين دهني، جنبا إلى جنب مع أسئلة أساسية حول كيفية إجراء هذه الرواية من البروتينات الدهنية وما الغرض الفسيولوجية أو ميزة نقل الأشكال المختلفة. وعلاوة على ذلك، أنها تبين بوضوح عجز الجينوم الحالية للتنبؤ ببنية البروتين الدهني. وفي الواقع، حددنا مؤخرا فئة رواية من البروتين الدهني ن-اشيل ترانسفيراسيس، تسمى يره، من فايكاليس البرازية و العصوية الشمعية التي تجعل من النموذج lyso البروتينات الدهنية9. وهذا يشير إلى ضرورة التحقق تجريبيا من هيكل البروتين الدهني، الذي يمكن أن تكون صعبة بسبب طبيعتها الغاية مسعور ومحدودية الأساليب المتاحة لتميز بنيتها الجزيئية.
لتسهيل الدراسات على بروتين دهني تحريض الاستجابة المناعية المضيفة، فضلا عن التصميم الهيكلي الطرفي ن، أننا قد تكيفت العديد من البروتوكولات المذكورة سابقا من أجل تنقية البروتينات الدهنية البكتيرية وإعداد تريبتيك N-المحطة ليبوبيبتيديس للتحليل باستخدام TOF MS6،10،،من1112. يتم إثراء البروتينات الدهنية باستخدام مرحلة X-114 تريتون (يشار إليه من الآن فصاعدا بالفاعل أو TX-114) أنشئت تقسيم الأسلوب الأمثل إزالة تلويث غير البروتينات الدهنية وزيادة غلة بروتين دهني. هذه البروتينات الدهنية مناسبة للاستخدام المباشر في فحوصات TLR أو لتنقية المزيد من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. TOF استخدام مرض التصلب العصبي المتعدد، يوفر نقل البروتينات الدهنية غشاء النيتروسليلوز سقالة للكفاءة في الموقع الهضم التربسين، غسل وشطف اللاحقة من سطح الغشاء، مما أدى إلى حد كبير تنقية ليبوبيبتيديس الطرفي ن. لقد ثبت النيتروسليلوز لتسهيل معالجة العينة وتحسين التغطية تسلسل للغاية مسعور الببتيدات من الغشاء لا يتجزأ البروتينات13،14، فضلا عن البروتينات الدهنية9،10 . يحتوي الأسلوب على ميزة إضافية لتجزئة الببتيدات استناداً إلى قطبية، حيث أن الحلول المتوسطة يغسل يمكن تحليلها لتحديد ثقة عالية البروتين في نفس الوقت مع التصميم الهيكلي الطرفي ن في تجربة واحدة . هذا البروتوكول فريد ميزات المتعمد الصوديوم adduct تكوين الرامية إلى تجزئة أيون الأصل نحو ديهيدروالانيل الأيونات خلال MS/MS، تساعد في تعيين الهيكلية للدولة-أسيليشن ن. ن-المحطة هو ميزة أكثر من متغير والرئيسية المتصلة باعتراف TLR البروتينات الدهنية. أخذت معا، سمح هذا البروتوكول دراسات مكثفة واستنساخه في البروتينات الدهنية، مع المراحل الفردية لتنقية والتصميم الهيكلي قبل استخدام TOF MS بسهولة تكييفها تبعاً للهدف العام لهذه التجربة.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول هنا يصف اثنان مراحل متميزة لتوصيف البروتين الدهني: الإثراء بتكساس-114 المرحلة تحديد التقسيم والهيكلية باستخدام TOF مرض التصلب العصبي المتعدد. أثناء استخراج TX-114، يزيل الطرد المركزي الإضافية تلويث البروتينات التي تتسبب في أثناء هذه العملية، تليها الأسيتون هطول الأمطار لإنتاج الب…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد البحث في مختبر ميريديث أموال بدء التشغيل المقدمة من “كلية العلوم ابيرلي” (جامعة ولاية بنسلفانيا). ونشكر الدكتور تاتيانا لاريموري على الخبراء تقديم المشورة التقنية والحصول على المعدات في بنسلفانيا الدولة البروتيوميات ووسائل قياس الطيف الكتلي الأساسية مرفق، جامعة بارك، السلطة الفلسطينية، حيث أجريت التحاليل والمطيافيه الجماعية.
Materials
| Materials | |||
| 0.01 mm Zirconia/silica beads | BioSpec Products | 110791012 | |
| Acetic acid | EMD | AX0073-9 | |
| Acetone | EMD | AX0116-6 | |
| Acetonitrile | EMD | AX0142-6 | |
| Ammonium bicarbonate | Fluka Analytical | 09830 | |
| BioTrace NT Nitrocellulose | PALL Life Sciences | 66485 | |
| Bovine serum albumin (BSA) digest standard | Protea | PS-204-1 | |
| Chloroform | Acros Organics | 423550025 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP118 | |
| HPLC Grade water | EMD | WX0008-1 | |
| Lysozyme | Fisher Scientific | BP535-1 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF) | Amresco | 0754 | |
| Pierce trypsin protease | Thermo Scientific | 90057 | |
| Ponceau S | Acros Organics | 161470100 | |
| Protein LoBind Tube 0.5mL | Eppendorf | 022431064 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 792519 | |
| Sodium chloride | Macron Fine Chemicals | 7581-06 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | 299537 | |
| Tris-hydrochloride (HCl) | Fisher Scientific | BP152 | |
| Triton X-114 | Sigma-Aldrich | 93422 | |
| Tryptic soy broth (TSB) | BD | 211822 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade) | Sigma-Aldrich | C8982 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MagNALyser | Roche | ||
| Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| MALDI-TOF target | Bruker Daltonics | ||
| Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF | Bruker Daltonics | Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser |
References
- Babu, M. M., et al. A database of bacterial lipoproteins (DOLOP) with functional assignments to predicted lipoproteins. J Bacteriol. 188 (8), 2761-2773 (2006).
- Narita, S., Tokuda, H. Bacterial lipoproteins; biogenesis, sorting and quality control. Biochim Biophys Acta. 1862 (11), 1414-1423 (2016).
- Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. Lipoproteins of bacterial pathogens. Infect Immun. 79 (2), 548-561 (2011).
- Nguyen, M. T., Götz, F. Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence. Microbiol Mol Biol Rev. 80 (3), 891-903 (2016).
- Nakayama, H., Kurokawa, K., Lee, B. L. Lipoproteins in bacteria: structures and biosynthetic pathways. FEBS J. 279 (23), 4247-4268 (2012).
- Kurokawa, K., et al. Novel bacterial lipoprotein structures conserved in low-GC content Gram-positive bacteria are recognized by Toll-like receptor 2. J Biol Chem. 287 (16), 13170-13181 (2012).
- Kurokawa, K., et al. The Triacylated ATP Binding Cluster Transporter Substrate-binding Lipoprotein of Staphylococcus aureus Functions as a Native Ligand for Toll-like Receptor 2. J Biol Chem. 284 (13), 8406-8411 (2009).
- Asanuma, M., et al. Structural evidence of α-aminoacylated lipoproteins of Staphylococcus aureus. FEBS J. 278 (5), 716-728 (2011).
- Armbruster, K. M., Meredith, T. C. Identification of the Lyso-Form N-Acyl Intramolecular Transferase in Low-GC Firmicutes. J Bacteriol. 199 (11), e00099-e00017 (2017).
- Serebryakova, M. V., Demina, I. A., Galyamina, M. A., Kondratov, I. G., Ladygina, V. G., Govorun, V. M. The acylation state of surface lipoproteins of Mollicute Acholeplasma laidlawii. J Biol Chem. 286 (26), 22769-22776 (2011).
- Feng, S. H., Lo, S. C. Induced mouse spleen B-cell proliferation and secretion of immunoglobulin by lipid-associated membrane proteins of Mycoplasma fermentans incognitus and Mycoplasma penetrans. Infect Immun. 62 (9), 3916-3921 (1994).
- Feng, S. H., Lo, S. C. Lipid extract of Mycoplasma penetrans proteinase K-digested lipid-associated membrane proteins rapidly activates NF-kappaB and activator protein 1. Infect Immun. 67 (6), 2951-2956 (1999).
- Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Spellman, D. S., Sun, T. -. T., Neubert, T. A. Analysis of electroblotted proteins by mass spectrometry: protein identification after Western blotting. Mol Cell Proteomics. 7 (2), 308-314 (2008).
- Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Sun, T. -. T., Neubert, T. A. Use of Nitrocellulose Membranes for Protein Characterization by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Anal Chem. 78 (14), 5102-5108 (2006).
- Kurokawa, K., et al. Environment-mediated accumulation of diacyl lipoproteins over their triacyl counterparts in Staphylococcus aureus. J Bacteriol. 194 (13), 3299-3306 (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Schӓgger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nat Protoc. 1, 16-22 (2006).
- Gravel, P. Protein Blotting by the Semidry Method. The Protein Protocols Handbook. , 321-334 (2002).
- Webster, J., Oxley, D. Protein Identification by Peptide Mass Fingerprinting using MALDI-TOF Mass Spectrometry. The Protein Protocols Handbook. , 1117-1129 (2009).
- Wilkins, M. R., et al. Detailed peptide characterization using PEPTIDEMASS – a World-Wide-Web-accessible tool. Electrophoresis. 18 (3-4), 403-408 (1997).
- Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).
- Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).
- Al-Saad, K. A., Zabrouskov, V., Siems, W. F., Knowles, N. R., Hannan, R. M., Hill, H. H. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of lipids: ionization and prompt fragmentation patterns. Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (1), 87-96 (2003).
