Fånga interaktion kineticsen av en jonkanal Protein med små molekyler av Bio-lager interferometri analysen
Summary
Protokollet här beskriver samspelet mellan renat hEAG1 ion kanal protein med liten molekyl lipid ligand fosfatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2). Mätningen visar att BLI kunde vara en potentiell metod för romanen småmolekylär ion kanal ligand screening.
Abstract
Bio-lager interferometry (BLI) analysen är ett värdefullt verktyg för att mäta protein-protein och protein-liten molekyl interaktioner. Här beskriver vi först tillämpningen av denna roman etikett-fri teknik att studera samspelet mellan mänsklig EAG1 (hEAG1) kanal proteiner med liten molekyl PIP2. hEAG1 kanal har erkänts som potentiella terapeutiska mål på grund av dess avvikande överuttryck i cancer och några vinst-av-funktion mutationer i vissa typer av neurologiska sjukdomar. Vi renas hEAG1 kanal proteiner från däggdjur stabilt uttryck system och mätt samspelet med PIP2 av BLI. Framgångsrik mätning av kinetik av bindningen mellan hEAG1 protein och PIP2 visar att BLI-analysen är en potentiell hög genomströmning-metod som används för romanen småmolekylär ligand screening i ion kanal farmakologi.
Introduction
Inriktning cell surface-tillgängliga ion kanal proteinerna med små molekyler erbjuder en enorm potential för ligand screening och biologiska drug discovery1,2,3. Således behövs ett lämpligt verktyg för att studera interaktionen mellan jonkanal och små molekyler och deras motsvarande funktion. Patch-clamp inspelningen har visat sig vara en unik och oersättlig teknik i ion kanal funktionell analys. Men att avgöra huruvida de små molekylerna direkt rikta jonkanaler kräver andra tekniker. Traditionellt användes radioaktivt ligand bindande analysen att iaktta nedbrytnings-och urlakningshastighet bindning mellan små molekyler och dess målproteinet Jonen kanaliserar. Användningen av denna teknik är dock begränsad på grund av dess krav i radioaktiv märkning och identifiering. Dessutom förhindrar det nödvändiga steget att märka små liganden i studien dess hjälp i många typer av jonkanaler utan känd specifik ligand. Några etikett-fri tekniker såsom NMR spektroskopi, röntgendiffraktion, hur provtagningsutrustningen skall thermophoresis (MST)4 och ytan plasmon resonans (SPR) har använts för att mäta de protein-liten molekyl interaktionerna. Men dessa typer av analyser brukar ge inte tillräcklig information på grund av svårigheten att få den fullängds protein, låg upplösning av dynamics, låg genomströmning och hög kostnad5. Till skillnad från dessa tekniker framstår bio-lager Interferometry (BLI) som en roman etikett-fri metod att övervinna dessa nackdelar för att upptäcka protein-liten molekyl interaktioner genom att immobilisera en små mängder protein prov på ytor biosensor och mäta den optiska ändra signaler6,7. Som en lovande biosensor plattform, utförs redan BLI teknik för att observera samspelet mellan små molekyler med naturligt vatten lösliga proteiner såsom en human monoklonal antikropp CR80208 och detaljerad analysförfarandet har rapporterats i en föregående artikel9. Även om nyckelroll som ion kanal protein för nya terapeutiska mål upptäckt har erkänts, har ion kanal protein-liten molekyl interaktion analysen utifrån BLI inte beskrivits.
Mänskligt eter à go-go kanaler (hEAG1) uttrycks i olika typer av cancerceller och centrala nervsystemet som gör kanal a potentiella terapeutiska mål för många cancerformer och neuronala sjukdomar10,11, 12,13,14. Den elektrofysiologiska studien i vårt labb har bekräftat den hämmande effekten av fosfatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) på hEAG1 kanal15. Baserat på våra resultat, testa PIP2 direkt interaktion med hEAG1 med hjälp av BLI teknik kan vara som en modell för andra typer av ion kanal protein-liten molekyl sammansatt samspel särskilt för de kanaler som saknas specifika ligander. Enligt instruktionerna BLI analys, vi förberedda biotinylerade hEAG1 proteiner och orörlig dem på ytan av streptividin (SA) biosensor tips följt av interaktion dem till PIP2 lösningar att observera deras direkta bindning mellan de protein och lipid. Efter fastsättning av PIP2 till hEAG1 protein belagda ytan och tjockleken på lagret på ytan ökar, vilket direkt korrelerar de spektrala skiftet och kan mätas i realtid16. Bindande kinetiken kan bestämmas på grund av en positiv förändring i föreningen steg och en negativ förändring i dissociation steg. Enligt denna princip, vi renat det funktionella hEAG1 ion kanal proteinet från HEK-239T stabilt uttryck systemet med hjälp av affinitet reningsmetod att in vitro- funktionella tillståndet, sedan mätt kineticsen av bindningen av olik koncentration PIP2, och gett en semblable kinetiska data som observerats i elektrofysiologiska mätningar15. Nära korrespondensen mellan resultaten från BLI och elektrofysiologiska mätningar visar för första gången BLI lämplighet som ett lämpligt analytiska verktyg för ion kanal membran protein-liten molekyl interaktion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Jonkanaler i membranet har verifierats som de primära terapeutiska mål på över 13 procent av för närvarande kända läkemedel för behandling av en mängd olika sjukdomar, däribland hjärt- och neurologiska störningar18. Patch-clamp inspelning, har den gyllengula standarden för att mäta den funktionella av jonkanaler med små molekyler, använts för ion kanal ligander screening. Dock sådan elektrofysiologiska metoder inte kan visa huruvida de små Molekylerna binder till kanalen direkt…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av Bio-ID Center och SJTU tvärvetenskapliga forskningsfond i medicin och teknik (YG2016QN66), National Natural Science Foundation Kina (31271217) och nationella grundläggande forskning Program i Kina (2014CB910304).
Materials
| DMEM/High Glucose Medium | HyClone | SH30243.01 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | HyClone | SH30256.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 1697550 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430599 | 150 mm X 25 mm |
| Nonidet P-40 Substitute | Amresco | E109 | |
| Sodium chloride | BBI Life Sciences | A610476 | |
| Potassium chloride | BBI Life Sciences | A610440 | |
| Bovine Serum Albumin | BBI Life Sciences | A600332 | |
| Polyoxyethylene-20-Sorbitan Monolaurate | BBI Life Sciences | A600560 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| 3x FLAG peptide | Sigma | F4799 | |
| Octet-RED96 | Pall/FortéBio | 30-5048 | |
| Data Acquisition software | Pall/FortéBio | Version 7.1 | |
| Data Analysis software | Pall/FortéBio | Version 7.1 | |
| Biosensor/Streptavidin | Pall/FortéBio | 18-5019 | |
| Microtiter plate | Greiner Bio-one | 655209 | |
| Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin | ThermoFisher | 21338 | |
| Centrifugal Machine | ThermoFisher | 75004250 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | ThermoScientific | 318120 | |
| Ultrafiltration device | MILLIPORE | UFC503008 | NMWL of 30 kDa |
| phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) | Sigma | P9763 | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody | Sigma | F1804 | 1:2000 dilution |
| goat anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | 1:5000 dilution |
| Enhanced BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0010 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04693159001 | |
| Amersham Imager 600 Imaging System | GE Healthcare Bio-Sciences | ||
| Western blot system | BIO-RAD |
References
- Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. Biophysical Interactions with Model Lipid Membranes: Applications in Drug Discovery and Drug Delivery. Mol. Pharm. 6 (5), 1264-1276 (2009).
- van de Waterbeemd, H., Smith, D. A., Beaumont, K., Walker, D. K. Property-based design: Optimization of drug absorption and pharmacokinetics. J. Med. Chem. 44 (9), 1313-1333 (2001).
- Papo, N., Shai, Y. Exploring peptide membrane interaction using surface plasmon resonance: Differentiation between pore formation versus membrane disruption by lytic peptides. Biochimie. 42 (2), 458-466 (2003).
- Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nat. Commun. 1, 100-106 (2010).
- Fechner, P., et al. Size does matter! Label-free detection of small molecule-protein interaction. Anal. Bioanal. Chem. 406 (17), 4033-4051 (2014).
- Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of Bio-Layer Interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. J. Pharm. Biomed. Anal. 72, 150-154 (2013).
- Wartchow, C. A., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. J. Comput. Aided Mol. Des. 25 (7), 669-676 (2011).
- Ekiert, D. C., et al. A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses. Science. 333 (6044), 843-850 (2011).
- Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects. J. Vis. Exp. (84), e51383 (2014).
- Occhiodoro, T., et al. Cloning of a human ether-a-go-go potassium channel expressed in myoblasts at the onset of fusion. Febs Lett. 434 (1-2), 177-182 (1988).
- Pardo, L. A., Stuhmer, W. Eag1: An emerging oncological target. Cancer. Res. 68 (6), 1611-1613 (2008).
- Simons, C., et al. Mutations in the voltage-gated potassium channel gene KCNH1 cause Temple-Baraitser syndrome and epilepsy. Nat. Genet. 47 (1), 73-77 (2015).
- Kortum, F., et al. Mutations in KCNH1 and ATP6V1B2 cause Zimmermann-Laband syndrome. Nat. Genet. 47 (6), 661-667 (2015).
- Han, B., Tokay, T., Zhang, G. M., Sun, P., Hou, S. Eag1 K+ Channel: Endogenous Regulation and Functions in Nervous System. Oxid. Med. Cell. Longev. 2017, (2017).
- Han, B., et al. Human EAG channels are directly modulated by PIP2 as revealed by electrophysiological and optical interference investigations. Sci. Rep. 6, (2016).
- Do, T., et al. A rapid method for determining dynamic binding capacity of resins for the purification of proteins. PREP. 60 (2), 147-150 (2008).
- Rohacs, T., Chen, J., Prestwich, G. D., Logothetis, D. E. Distinct specificities of inwardly rectifying K+ channels for phosphoinositides. J. Biol. Chem. 274 (51), 36065-36072 (1999).
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there?. Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).
- Suh, B. C., Hille, B. PIP2 is a necessary cofactor for ion channel function: How and why?. Annu. Rev. Biophys. 37, 175-195 (2008).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms. J. Vis. Exp. (122), e55659 (2017).
