Het combineren van kwantitatieve voedselinname-Assays en onder dwang activeren neuronen om te bestuderen van eetlust in Drosophila
Summary
Kwantitatieve voedselinname testen met geverfd voedsel bieden een robuuste en high-throughput betekent om voeding motivatie. De voedsel consumptie-bepaling te combineren met thermogenetic en optogenetic schermen is een krachtige aanpak van de onderzoeken van de neurale circuits die ten grondslag liggen aan de eetlust in volwassen Drosophila melanogaster.
Abstract
De voedselconsumptie is onder de strakke controle van de hersenen, die integreert de fysiologische status, smakelijkheid en voeding inhoud van de voedingsmiddelen, en kwesties opdrachten starten of stoppen van de voeding. Ontcijferen van de processen die ten grondslag liggen aan de besluitvorming van tijdige en matig voeden draagt grote gevolgen in ons begrip van de fysiologische en psychologische aandoeningen gerelateerd aan het voeden van de controle. Robuuste, eenvoudige en kwantitatieve methoden zijn vereist voor het meten van de inname van het voedsel van dieren na experimentele manipulatie, zoals gedwongen het verhogen van de activiteiten van bepaalde doel neuronen. Hier, introduceerden we kleurstof labeling-gebaseerde voeding tests om te vergemakkelijken de neurogenetic studie van het voederen van controle in volwassen fruitvliegjes. Wij bekijken beschikbaar voeding testen en vervolgens beschrijven onze stap voor stap van setup analyse, die combineren thermogenetic en optogenetic manipulatie van neuronen controleren voeding motivatie met kleurstof-geëtiketteerden voedsel inname test methoden. Ook bespreken we de voordelen en beperkingen van onze methodes, in vergelijking met andere voeding testen, om te helpen lezers kiezen van een passende bepaling.
Introduction
Kwantificeren van de hoeveelheid geconsumeerd voedsel is belangrijk voor de evaluatie van meerdere aspecten van het voederen van controles door de hersenen in reactie op de interne behoeften (zoals honger de Staten) en externe factoren (zoals voedselkwaliteit en smakelijkheid)1, 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9. in de afgelopen jaren, de inspanningen van het ontcijferen van de neurale substraten controle te voeden in Drosophila leiden tot de ontwikkeling van meerdere tests rechtstreeks kwantificeren van de hoeveelheid voedsel geconsumeerd of dienen als een indicator van het voederen van motivatie 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16.
De capillaire FEeder (CAFE) assay12,13 werd ontwikkeld voor het meten van de hoeveelheid verbruik van vloeibaar voedsel in een glas microcapillary. De CAFE-bepaling is zeer gevoelig en reproduceerbare17 en vereenvoudigt de meting van de voedselconsumptie, vooral voor het kwantificeren van de lange termijn voeding18. Deze test vereist echter de vliegen te klimmen naar het uiteinde van de microcapillary en feed ondersteboven, die is niet geschikt voor alle stammen. Bovendien, omdat de vliegen te worden getest met behulp van de CAFE-bepaling worden gehouden op vloeibaar voedsel moeten, het effect van deze voorwaarden op metabolisme status of de potentiële ondervoeding fokken moet nog worden bepaald.
De reactie van de uitbreiding van Proboscis (PER) assay11,14 telt de frequentie van proboscis extensie reacties naar zachte aanrakingen van voedsel druppels. PER assay bewezen als een uitstekende manier om te evalueren door motivatie van individuele fly en ezels te voeden de invloed van de smakelijkheid en inhoud van voedsel18,19. Het is echter niet een directe kwantificering van inname bedrag.
Onlangs, een semi-automatische methode, de handleiding voederen assay (MAFE)15, werd ontwikkeld. In MAFE, wordt een enkele geïmmobiliseerdet vlieg handmatig gevoed met een levensmiddel bevatten microcapillary. Gezien het feit dat proboscis extensie reacties en voedselconsumptie kunnen gelijktijdig worden gecontroleerd, leent MAFE zich voor de beoordeling van de nutriënten waarden en de effecten van farmacologische manipulatie. Echter immobilizing een vlieg kan negatieve gevolgen hebben zijn gedrags prestaties, met inbegrip van voeding.
Bovendien vliegen Proboscis en activiteit Detector (FlyPAD)10 werd ontwikkeld om de voeding gedrag automatisch te kwantificeren. Met behulp van machine vision methoden registreert FlyPAD fysieke interactie tussen een vlieg en voedsel te kwantificeren van de frequentie en duur van proboscis extensies als een indicator van het voederen van motivatie. FlyPAD biedt een high-throughput benadering te volgen van de voeding gedrag van een gratis voortbewegende vliegen, hoewel de gevoeligheid en de degelijkheid van dit systeem moet nog verder worden bevestigd door meer studies12.
Labeling strategieën worden vaak gebruikt om te schatten van voedsel inname in vliegen. Het is gebruikelijk om voedsel van een label met chemische verklikstoffen en meten na de voeding, de hoeveelheid geconsumeerde tracer voor het berekenen van de hoeveelheid voedselinname. Radioactieve tracers16,17,20,21,22,23,24,25 voldoende zijn voor de detectie via de cuticula zonder de homogenisering van de vliegen. Deze methode biedt opmerkelijk lage variabiliteit en hoge gevoeligheid18, en is haalbaar voor lange termijn studie van de voedselinname. Echter, de beschikbaarheid van de bruikbare radioactieve isotopen en de verschillende tarieven van absorptie en excretie moeten rekening worden gehouden bij het werken met deze test.
Labelen en tracering van de voedselinname met niet-giftig voedsel kleuren is een veiliger en eenvoudiger alternatief2,3,26,27,28. Vliegen zijn gehomogeniseerd na de voeding met levensmiddelen die oplosbare en niet-absorbeerbare kleurstoffen bevatten, en het bedrag van de geconsumeerde kleurstof is later gekwantificeerd aan de hand van een spectrofotometer3,24,28,29 . De labeling strategie is gemakkelijk uit te voeren en biedt hoge efficiëntie, maar met een waarschuwing. Het volume van de voedselinname geschatte vanuit de geconsumeerde kleurstof is kleiner dan het werkelijke volume omdat uitscheiding zo spoedig 15 min begint na het vliegen beginnen eten van17. Bovendien beoordeelt de assay voedsel inname meestal binnen een termijn van 60-min, die alleen geschikt voor onderzoek van kortlopende voeding gedrag24,28 is. Bovendien meerdere interne en externe factoren, zoals genotype17, gender17, gekruist staat17, fokken dichtheid30, circadiane ritme31,32, en voedsel kwaliteit3 , 8 , 16, invloed voedselinname. Daarom is de voeding duur wellicht worden aangepast volgens specifieke experimentele omstandigheden. Naast het vergemakkelijken van de kwantificering van de voedselinname, worden voedsel kleuren ook gebruikt om te beoordelen van voedsel keuzes2,19,27, en visualiseren van de meniscus in een microcapillary in CAFE assay12.
Hier introduceren we een protocol gecombineerd manipulatie van neuronale activiteit met kleurstof-labeling aanpak. Deze strategie heeft bewezen nuttig in onze neurogenetic studie op het vervoederen aan controle in volwassen fruitvliegjes24. De visuele scoren methode zorgt voor een snelle schatting van de voedselconsumptie; het is dus nuttig voor screening door middel van een groot aantal stammen in een tijdig. De kandidaten van het scherm worden vervolgens geanalyseerd in detail met behulp van een colorimetrische methode om objectieve en precieze kwantificering in aanvullende studie.
Naast de voeding testen, we ook thermogenetic27,33,34,35 en optogenetic36 worden de methoden beschreven doel neuronen in Drosophilaonder dwang om te activeren. Activeren van neuronen met thermogenetic bediening is eenvoudig en handig met Drosophila voorbijgaande Receptor potentiële Ankyrin 1 (dTRPA1), die een temperatuur – en spanning-gated catie kanaal dat neuronale prikkelbaarheid verhoogt wanneer de omgevingstemperatuur temperatuur stijgt boven 23 ° C33,37; testen van dieren bij hoge temperaturen kan produceren echter bijwerkingen op het gedrag. Een andere doeltreffende benadering van neuronen in Drosophila activeren is met behulp van optogenetics met CsChrimson36, die is een rood-verschoven variant van channelrhodopsin die een toename van de prikkelbaarheid van neuronen bij blootstelling aan licht. Optogenetics biedt hogere temporele resolutie en minder verstoring om gedrag dan thermogenetics. De kwantitatieve meting van de voedselinname te combineren met de manipulatie van neuronale activiteit geeft een effectieve aanpak voor het bestuderen van de neurale mechanismen van voeding.
We beschrijven in detail de bereiding van de voeding zaal en de vliegen te beproeven. Met behulp van Taotie-Gal4 vliegen als een model24, beschrijven we activerende neuronen door thermogenetics en optogenetics. Twee tests van kwantificering van de voedselconsumptie met kleurstof-geëtiketteerden voedsel worden ook beschreven in het protocol.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit rapport richt zich op het technische proces van kleurstof-labeling voeding tests van de voedselconsumptie in de context van thermogenetic en optogenetic activering te manipuleren neuronen controleren van voeding. Dit eenvoudig en betrouwbaar protocol zal bijdragen tot het ophelderen van de functie van neuronen van de kandidaat voor het voederen van controle, voor het meten van de voedsel-voorkeur van vliegen en identificeren van nieuwe spelers in de voeding aanstuurkringen via genetische schermen voederen gebaseerde<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door nationale Basic Research programma van China (2012CB825504), National Natural Science Foundation of China (91232720 en 9163210042), Chinese Academie van Wetenschappen (CAS) (GJHZ201302 en QYZDY-SSW-SMC015), Bill en Melinda Gates Stichting (OPP1119434), en 100-talenten programma van CA’s Y. Zhu.
Materials
| UAS-CsChrimson | Bloomintoon | 55135 | |
| UAS-dTrpA1 | Bloomintoon | 26263 | |
| TDC1-GAL4 | Bloomintoon | 9312 | |
| TDC2-GAL4 | Bloomintoon | 9313 | |
| sNPF-GAL4 | Provided by Z. Zhao | ||
| NPF-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| TH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| 5-HT-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| AKH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| dip2-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| Taotie-GAL4 | Provided by J. Carlson | ||
| Agarose | Biowest | G-10 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Erioglaucine disodium salt | Sigma | 861146 | |
| all-trans-retinal | Sigma | R2500 | stored in darkness |
| Triton X-100 | Amresco | 9002-93-01 | |
| Fly food | 1 L food contains: 77.7 g corn meal, 32.19 g yeast, 5 g agar, 0.726 g CaCl2, 31.62 g sucrose, 63.2 g glucose, 2 g potassium sorbate, pH | ||
| 1x PBS buffer | 1 L 1X PBS contains: 8 g Nacl, 0.2 g Kcl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, pH 7.4 | ||
| PBST buffer | 1X PBS with 1% Triton X-100 | ||
| Grinding mill | Shang Hai Jing Xin | Tissuelyser-24 | |
| Incubator | Ning Bo Jiang Nan | HWS-80 | |
| Magnetic stirrer with a heat plate | Chang Zhou Bo Yuan | CJJ 78-1 | |
| Spectrometer | Thorlabs | CCS200/M | |
| Microplate Spectrophotometer | Thermo Scientific | Multiskan GO Type: 1510, REF 51119200 | |
| Fluorescence stereo microscope | Leica | M205FA | |
| Stereo microscope | Leica | S6E | |
| Outside container | Jiang Su Hai Men | glass vial with a diameter of 31.8 mm and a height of 80 mm (inside dimension) | |
| Inside container | Beijing Yi Ran machinery factory | plastic dish with a diameter of 13.6 mm and a height of 7.5 mm (inside dimension) | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Hai Men Ning Mong | ||
| 96 well plate | Corning Incorporated | Costar 3599 | |
| LEDs | Xin Xing Yuan Guangdian | 607 nm, 3W | https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058 |
References
- Gao, Q., Horvath, T. L. Neurobiology of feeding and energy expenditure. Annu Rev Neurosci. 30, 367-398 (2007).
- Bjordal, M., Arquier, N., Kniazeff, J., Pin, J. P., Leopold, P. Sensing of amino acids in a dopaminergic circuitry promotes rejection of an incomplete diet in Drosophila. Cell. 156 (3), 510-521 (2014).
- Edgecomb, R. S., Harth, C. E., Schneiderman, A. M. Regulation of feeding behavior in adult Drosophila melanogaster varies with feeding regime and nutritional state. J Exp Biol. 197, 215-235 (1994).
- Miyamoto, T., Slone, J., Song, X., Amrein, H. A fructose receptor functions as a nutrient sensor in the Drosophila brain. Cell. 151 (5), 1113-1125 (2012).
- Morton, G. J., Cummings, D. E., Baskin, D. G., Barsh, G. S., Schwartz, M. W. Central nervous system control of food intake and body weight. Nature. 443 (7109), 289-295 (2006).
- Pool, A. H., Scott, K. Feeding regulation in Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 29, 57-63 (2014).
- Soderberg, J. A., Carlsson, M. A., Nassel, D. R. Insulin-Producing Cells in the Drosophila Brain also Express Satiety-Inducing Cholecystokinin-Like Peptide, Drosulfakinin. Front Endocrinol (Lausanne). 3, 109 (2012).
- Stafford, J. W., Lynd, K. M., Jung, A. Y., Gordon, M. D. Integration of taste and calorie sensing in Drosophila. J Neurosci. 32 (42), 14767-14774 (2012).
- Wu, Q., Zhang, Y., Xu, J., Shen, P. Regulation of hunger-driven behaviors by neural ribosomal S6 kinase in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13289-13294 (2005).
- Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nat Commun. 5, 4560 (2014).
- Mair, W., Piper, M. D., Partridge, L. Calories do not explain extension of life span by dietary restriction in Drosophila. PLoS Biol. 3 (7), e223 (2005).
- Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (121), (2017).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. J Vis Exp. (3), e193 (2007).
- Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Mol Brain. 8, 87 (2015).
- Ja, W. W., et al. Water- and nutrient-dependent effects of dietary restriction on Drosophila lifespan. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18633-18637 (2009).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Deshpande, S. A., et al. Acidic Food pH Increases Palatability and Consumption and Extends Drosophila Lifespan. J Nutr. 145 (12), 2789-2796 (2015).
- Dus, M., Min, S., Keene, A. C., Lee, G. Y., Suh, G. S. Taste-independent detection of the caloric content of sugar in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (28), 11644-11649 (2011).
- Shen, P., Cai, H. N. Drosophila neuropeptide F mediates integration of chemosensory stimulation and conditioning of the nervous system by food. J Neurobiol. 47 (1), 16-25 (2001).
- Yang, Z., et al. Octopamine mediates starvation-induced hyperactivity in adult Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (16), 5219-5224 (2015).
- Ramdya, P., Schneider, J., Levine, J. D. The neurogenetics of group behavior in Drosophila melanogaster. J Exp Biol. 220 (Pt 1), 35-41 (2017).
- Sanchez-Alcaniz, J. A., Zappia, G., Marion-Poll, F., Benton, R. A mechanosensory receptor required for food texture detection in Drosophila. Nat Commun. 8, 14192 (2017).
- Zhan, Y. P., Liu, L., Zhu, Y. Taotie neurons regulate appetite in Drosophila. Nat Commun. 7, 13633 (2016).
- Yu, Y., et al. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife. 5, (2016).
- Wood, J. G., et al. Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans. Nature. 430 (7000), 686-689 (2004).
- Inagaki, H. K., et al. Visualizing Neuromodulation In Vivo: TANGO-Mapping of Dopamine Signaling Reveals Appetite Control of Sugar Sensing. Cell. 148 (3), 583-595 (2012).
- Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. Quantification of food intake in Drosophila. PLoS One. 4 (6), e6063 (2009).
- Sen, R., et al. Moonwalker Descending Neurons Mediate Visually Evoked Retreat in Drosophila. Curr Biol. 27 (5), 766-771 (2017).
- Ewing, L. S., Ewing, A. W. Courtship of Drosophila melanogaster in large observation chambers: the influence of female reproductive state. Behaviour. 101 (1), 243-252 (1987).
- Chatterjee, A., Tanoue, S., Houl, J. H., Hardin, P. E. Regulation of gustatory physiology and appetitive behavior by the Drosophila circadian clock. Curr Biol. 20 (4), 300-309 (2010).
- Xu, K., Zheng, X., Sehgal, A. Regulation of feeding and metabolism by neuronal and peripheral clocks in Drosophila. Cell Metab. 8 (4), 289-300 (2008).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-255 (2008).
- Viswanath, V., et al. Ion channels – Opposite thermosensor in fruitfly and mouse. Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).
- Yu, Y., et al. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife. 5, (2016).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Viswanath, V., et al. Opposite thermosensor in fruitfly and mouse. Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lee, K. S., You, K. H., Choo, J. K., Han, Y. M., Yu, K. Drosophila short neuropeptide F regulates food intake and body size. J Biol Chem. 279 (49), 50781-50789 (2004).
- Marella, S., Mann, K., Scott, K. Dopaminergic Modulation of Sucrose Acceptance Behavior in Drosophila. Neuron. 73 (5), 941-950 (2012).
- Albin, S. D., et al. A Subset of Serotonergic Neurons Evokes Hunger in Adult Drosophila. Current Biology. 25 (18), 2435-2440 (2015).
- Ro, J., et al. Serotonin signaling mediates protein valuation and aging. eLife. 5, e16843 (2016).
